張文平，劉 姿，賈建超，魏 立，張曉菊

1)河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院；河南大學(xué)人民醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院；河南大學(xué)人民醫(yī)院)胸外科 鄭州 450003

人氣道基底細(xì)胞存在于氣管和直徑大于1 mm的支氣管上皮內(nèi)，是肺內(nèi)源性干細(xì)胞的一種。研究[1]表明氣道基底細(xì)胞中存在多能干細(xì)胞，其可隨機(jī)分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。這一特點(diǎn)決定了人氣道基底細(xì)胞在肺損傷修復(fù)中發(fā)揮一定的作用。利用人氣道基底細(xì)胞生成的類氣管球成熟后由復(fù)層纖毛細(xì)胞、分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞組成[2]。由氣道基底細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得的類氣管球可用于研究調(diào)節(jié)基底細(xì)胞增殖和分化的小分子和藥物，也可用于研究治療纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞比例失調(diào)疾病(哮喘、慢性阻塞性肺疾病和囊性纖維化等)的新方法。本研究應(yīng)用人氣道基底細(xì)胞構(gòu)建類氣管球，并觀察不同來源的基底細(xì)胞所形成類氣管球的差別。

1 材料與方法

1.1 材料肺組織來源于河南省人民醫(yī)院肺移植中心肺移植手術(shù)棄用的供肺。主要試劑：含谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司),EpiX Base培養(yǎng)基(Propagenix 公司)，Ham′s F-12 Nutrient Mix完全培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司)，膠原酶P、蛋白酶ⅩⅣ、DNA酶Ⅰ、膠原蛋白溶液、KRT5單抗、PKH26熒光細(xì)胞膜染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)，基質(zhì)膠(Corning公司)，p63-α(D2K8X) XP?兔單抗(Cell Signaling Technology公司)，MUC5A 單抗、FOXJ1單抗、山羊抗雞 488抗體、山羊抗鼠555(Thermo Scientific公司),山羊抗兔647抗體(Novus Biologicals公司)。自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀2000(Nexcelom Biosicence公司)，倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡。

1.2 原代人肺成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)于超凈工作臺使用無菌手術(shù)剪將肺組織(來自一名77歲男性，無肺部基礎(chǔ)疾病)剪成細(xì)小碎片(約1 mm3)，加入0.5 g/L胰蛋白酶-EDTA酚紅，37 ℃水浴10 min后用無菌紗布過濾，濾液1 600 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液5 min后離心，以完全培養(yǎng)基重懸，1 600 r/min離心5 min，棄上清，再重懸細(xì)胞。將所得細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，以Ham′s F-12 Nutrient Mix完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得細(xì)胞為肺成纖維細(xì)胞。細(xì)胞融合度80%左右時可進(jìn)行傳代。細(xì)胞保存于含體積分?jǐn)?shù)10%二甲基亞砜的胎牛血清中，液氮罐內(nèi)長期保存。

1.3 人氣道基底細(xì)胞的分離培養(yǎng)使用酶消化法從人氣管或支氣管標(biāo)本分離氣道基底細(xì)胞。第1天以蛋白酶和DNA酶Ⅰ消化氣管和支氣管組織，第2天以手術(shù)刀片輕輕搔刮氣管或支氣管內(nèi)膜，收集細(xì)胞接種于膠原蛋白溶液包被的T75或T175長頸培養(yǎng)瓶，用EpiX Base培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h。所得細(xì)胞經(jīng)KRT5和P63免疫熒光染色鑒定為氣道基底細(xì)胞。細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時可進(jìn)行傳代。建議人氣道基底細(xì)胞保存于第一代。

1.4 類氣管球的體外培養(yǎng)與鑒定所有操作均在超凈工作臺內(nèi)完成。取24孔板，每孔用100 μL體積比1∶1混合的基質(zhì)膠與EpiX Base培養(yǎng)基包被，冰上操作。然后將24孔板置于37 ℃溫箱中30 min使凝膠固化。

使用PKH26預(yù)染人肺成纖維細(xì)胞胞膜(紅色)，以在熒光顯微鏡下區(qū)分氣道基底細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞。冰上分別將氣道基底細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞重懸于冷的EpiX Base培養(yǎng)基中，充分混勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。將100 μL細(xì)胞懸液(含基底細(xì)胞及肺成纖維細(xì)胞各5×104個)與等體積基質(zhì)膠混勻，所得細(xì)胞懸液接種于24孔板，每孔200 μL。將培養(yǎng)板置于37 ℃溫箱30 min，待凝膠固化后每孔加入700 μL EpiX Base培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2溫箱、37 ℃培養(yǎng)。隔日更換EpiX Base培養(yǎng)基。定期觀察細(xì)胞形態(tài)及有無類氣管球形成。以單獨(dú)培養(yǎng)的基底細(xì)胞或肺成纖維細(xì)胞為對照。

棄去培養(yǎng)基，每孔加入福爾馬林1 mL靜置2 h。將固定后的類氣管球轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，400×g離心6 min。加1 mL體積分?jǐn)?shù)0.3%Triton-X100室溫下透化1 h，400×g離心6 min，棄上清。加30 g/L牛血清白蛋白(溶于PBS)室溫下封閉1～2 h，400×g離心6 min，棄上清。以200 μL PBS重懸，轉(zhuǎn)移至玻璃底的24孔板內(nèi)，每孔10 μL。加一抗KRT5(1∶1 000稀釋)、P63-α(1∶800稀釋)、MUC5A(1∶150稀釋)、FOXJ1(1∶200稀釋)，4 ℃過夜。加二抗山羊抗雞488、山羊抗鼠555、山羊抗兔647抗體(均按1∶2 000稀釋)，室溫1 h，400×g離心6 min。然后以DAPI復(fù)染細(xì)胞核。

1.5 老年株、青年株基底細(xì)胞類氣管球形成效率的比較分離青年和老年健康供者的氣道基底細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞，方法同上。分別將青年株、老年株氣道基底細(xì)胞和青年株、老年株肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察形成的類氣管球的大小和數(shù)量。聯(lián)合培養(yǎng)前氣道基底細(xì)胞老年株細(xì)胞活性為71.6%，青年株為84.0%，人肺成纖維細(xì)胞老年株活性為93.0%，青年株為90.0%。

2 結(jié)果

2.1 類氣管球的鏡下表現(xiàn)培養(yǎng)第11天，氣道基底細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或與肺成纖維細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)均可見類氣管球形成，肺成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)無類氣管球形成(圖1)。氣道基底細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)形成的類氣管在鏡下呈球形，隨著培養(yǎng)時間延長球體直徑逐漸增大，14～21 d時達(dá)峰值。

A、B、C：分別為氣道基底細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)、氣道基底細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、肺成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；1、2：分別為亮視野和暗視野，暗視野下B2未見紅色熒光，說明無肺成纖維細(xì)胞

2.2 類氣管球的細(xì)胞組成氣道基底細(xì)胞所形成的類氣管球結(jié)構(gòu)示意圖見圖2A，類氣管球表面為基底細(xì)胞，纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞分布在管腔內(nèi)。免疫熒光染色可見基底細(xì)胞(KRT5+P63+)分布于類氣管球體表面，纖毛細(xì)胞(FOXJ1+)和分泌細(xì)胞(MUC+)分布在管腔內(nèi)部(圖2B、C)；纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞均由基底細(xì)胞分化而來。

A：類氣管球示意圖；B：類氣管球外部分布著表達(dá)KRT5(綠色熒光)和P63(紅色熒光)的基底細(xì)胞(免疫熒光染色，×400)；

2.3 老年株、青年株基底細(xì)胞類氣管球形成效率的比較來源于青年和老年健康供者的氣道基底細(xì)胞分別與來源于青年和老年健康供者的肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，可以觀察到形成類氣管球的大小和數(shù)量存在區(qū)別(圖3)；全視野下(圖4)可見，培養(yǎng)第20天，與基底細(xì)胞青年株相比，基底細(xì)胞老年株與成纖維細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)所形成的類氣管球直徑更大，數(shù)量更多。

3-1、3-2：氣道基底細(xì)胞老年株分別與肺成纖維細(xì)胞青年、老年株共培養(yǎng)，箭頭所示球體或類球體為類氣管；3-3、3-4：氣道基底細(xì)胞青年株分別與肺成纖維細(xì)胞青年、老年株共培養(yǎng)，箭頭所示球體或類球體為類氣管

A、B：氣道基底細(xì)胞老年株(Basal Cell Old)分別與肺成纖維細(xì)胞青年株(hLF Young)及肺成纖維細(xì)胞老年株(hLF Old)共培養(yǎng)20 d；C、D：氣道基底細(xì)胞青年株(Basal Cell Young)分別與hLF Young及hLF Old共培養(yǎng)20 d

3 討論

目前體外類肺器官可提供研究細(xì)胞間相互作用的平臺，也是體外合成可植入氣道組織治療慢性肺部疾病的第一步。人氣道基底細(xì)胞中存在多能干細(xì)胞，可隨機(jī)分化為分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定，在肺損傷修復(fù)過程中發(fā)揮作用。原代人氣道基底細(xì)胞的分離常采用以下3種臨床標(biāo)本：①因挫傷嚴(yán)重或感染廢棄不用的肺移植供肺或單肺移植時非手術(shù)側(cè)的供肺、供肺減容的部分。②切除的病肺。③支氣管鏡檢查時刷檢或活檢標(biāo)本。前兩種標(biāo)本可用于實(shí)驗(yàn)室研究，并建立細(xì)胞庫。用第3種方法獲取的標(biāo)本體外與不能進(jìn)行有絲分裂的肺成纖維細(xì)胞在Rho激酶抑制劑存在的情況下共培養(yǎng)，可快速擴(kuò)增氣道基底細(xì)胞，用于人工氣管的生物工程臨床研究[3]。

本研究利用廢棄供肺的氣管或支氣管分離人氣道基底細(xì)胞，利用肺組織分離成纖維細(xì)胞。人氣道基底細(xì)胞非常敏感，在分離和培養(yǎng)過程中應(yīng)嚴(yán)格按照操作方案要求，尤其應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①嚴(yán)格遵守各步驟對溫度、時間、轉(zhuǎn)速等的要求。②在使用無菌手術(shù)刀搔刮氣管或支氣管內(nèi)膜時避免過深突破基底膜，以避免其他類型細(xì)胞的污染。③由于肺是開放器官，在基底細(xì)胞分離培養(yǎng)過程中應(yīng)注意到污染的概率較大。④由于基底細(xì)胞具有分化能力，建議保存第一代細(xì)胞用于研究。

本研究結(jié)果表明類氣管球可由基底細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)生成，也可由基底細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)生成；免疫熒光染色證實(shí)類氣管球表面分布著基底細(xì)胞，腔內(nèi)可見纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞。既往文獻(xiàn)[2,4]報(bào)道，人肺成纖維細(xì)胞和氣道基底細(xì)胞共培養(yǎng)，或在培養(yǎng)基中添加Rho激酶抑制劑可將類器官形成的效率由10%提高到20%。在類器官培養(yǎng)體系中，肺成纖維細(xì)胞缺失時，肺上皮細(xì)胞的自凝聚現(xiàn)象減弱，且無法形成管狀結(jié)構(gòu)。抑菌素、Rho激酶抑制劑Y27632、肌動蛋白聚合細(xì)胞松弛素D均具有影響肌動球蛋白介導(dǎo)收縮的作用，從而促進(jìn)體外類器官形成管狀結(jié)構(gòu)并使其體積增大[5-6]。

有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)氣道基底細(xì)胞老年株與人肺成纖維細(xì)胞老年株或青年株共培養(yǎng)均較基底細(xì)胞青年株形成類氣管的數(shù)量多且體積大，但仍需要更多細(xì)胞株，并優(yōu)化計(jì)數(shù)、直徑測量方法，進(jìn)一步比較證實(shí)，具體機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。結(jié)合Mou等[7]的研究，轉(zhuǎn)化生成因子β(TGFβ)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/SMAD信號通路在氣道基底細(xì)胞的增殖和分化過程中起重要作用；SMAD磷酸化可促進(jìn)基底細(xì)胞的分化，敲除TGFβ/BMP基因和抑制藥物均可阻礙基底細(xì)胞分化為纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞。氣道基底細(xì)胞的老年株和青年株可能在TGFβ/BMP/SMAD信號通路的基因表達(dá)和調(diào)節(jié)方面存在一定差異，可進(jìn)行相關(guān)的研究進(jìn)一步探討。

體外類肺器官是一個較新的研究領(lǐng)域。本研究成功在體外構(gòu)建了類氣管球模型，其可在體外模擬氣道生理，為氣道的發(fā)生發(fā)育、生理和疾病相關(guān)研究提供模型支持。