譚小東，楊世龍，王麗，許娜娜，徐文龍，周沛，張艷飛，周鋒

狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人獸共患傳染病，一旦發(fā)病，病死率幾乎100%［1］。接種疫苗是預(yù)防狂犬病唯一有效的方式，其中人二倍體細(xì)胞基質(zhì)（如MRC-5 細(xì)胞）生產(chǎn)的狂犬病疫苗有著免疫效果好、副反應(yīng)低、免疫持久性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)［2-7］。本研究根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則要求，分別從全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)（研究專題代號(hào)12006-14001）、肌肉刺激性（研究專題代號(hào)12006-13004，12006-16001）、單次給藥毒性（研究專題代號(hào)12006-13001）和溶血性（研究專題代號(hào)12006-13002）四個(gè)方面，評(píng)價(jià)凍干人用狂犬病疫苗（MRC-5 細(xì)胞）的非臨床安全性?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 疫苗凍干人用狂犬病疫苗（MRC-5細(xì)胞）按照企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制備，檢定合格后用于動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)研究，批號(hào)分別為20140101和20141104。系采用MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)PM株狂犬病病毒，經(jīng)滅活、純化和凍干后制得。疫苗成品中含有人血白蛋白等賦形保護(hù)劑。

對(duì)照疫苗系市售凍干人用狂犬病疫苗（Vero 細(xì)胞，廣州諾誠(chéng)生物制品股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)S20083040，批號(hào)201308073-2），含有人血白蛋白等賦形保護(hù)劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性研究用清潔級(jí)新西蘭白兔購(gòu)自山東青島康大生物科技有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)分別為0021455和0025613，青島康大生物科技有限公司簽發(fā)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)分別為SCXK（魯）20110001 和SCXK（魯）20160002，由山東省科學(xué)技術(shù)廳簽發(fā)］，SPF級(jí)Hartley豚鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)11400700063326，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司簽發(fā)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK（京）2012-0001，由北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)簽發(fā)］，SPF級(jí)ICR小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為2008001639387，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司簽發(fā)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK（滬）2013-0016］。

本研究起止時(shí)間為2014年3月至2016年10月，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有存活的動(dòng)物均實(shí)施安樂死。

1.3 安全性研究該研究根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（NMPA）《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》［8］、《預(yù)防用生物制品臨床前安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》［9］、《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》［10］和《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［11］要求，制定相關(guān)研究方案并執(zhí)行。

1.3.1 全身主動(dòng)過敏試驗(yàn) 取SPF 級(jí)Hartley 豚鼠共84只，稱重后按其性別和體質(zhì)量通過簡(jiǎn)單隨機(jī)化分配步驟分為六組，每組12只動(dòng)物，雌雄各半。

試驗(yàn)分為兩個(gè)階段，第一階段為致敏階段，隔日注射1 次，共給藥3 次。低劑量和高劑量給藥組給予凍干人用狂犬疫苗（MRC-5 細(xì)胞），每只劑量分別為不低于1.25 IU 和不低于2.5 IU，上市對(duì)照組每只不低于2.5 IU 給予凍干人用狂犬病疫苗（vero 細(xì)胞）、陽性對(duì)照組每只給予卵清蛋白2 mg、兩種賦形劑對(duì)照組分別為含人血白蛋白和不含人血白蛋白。通過腹腔注射，低劑量組每只按0.5 mL 給藥，其余組均按每只1.0 mL給藥。

第二階段為激發(fā)階段。各組在末次致敏注射后第14天或第21天激發(fā)一次。通過足靜脈推注給藥，低劑量組按日1.0 mL給藥、其余組均按日2.0 mL給藥。

實(shí)驗(yàn)期間每天進(jìn)行一次詳細(xì)的動(dòng)物臨床觀察，并根據(jù)觀察結(jié)果評(píng)價(jià)動(dòng)物全身致敏性情況。全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)［12］，分別標(biāo)記為陰性“－”、弱陽性“＋”、陽性“＋＋”、強(qiáng)陽性“＋＋＋”和極強(qiáng)陽性“＋＋＋＋”。

1.3.2 單次給藥肌肉刺激試驗(yàn) 取清潔級(jí)新西蘭白兔，稱重后按其性別和體質(zhì)量通過簡(jiǎn)單隨機(jī)化分配步驟分為兩組，每組雌雄各2只，分別作為賦形劑對(duì)照組和給藥組。

賦形劑對(duì)照組給予疫苗賦形劑（含人血白蛋白），給藥組給予疫苗。賦形劑對(duì)照組和給藥組每只按1.0 mL 給藥體積，通過左側(cè)股四頭肌給藥1 次（d0）。動(dòng)物分2 次解剖檢查，每組首次各剖檢2 只，雌雄各半；第二次剖檢余下動(dòng)物。兩次解剖時(shí)間分別為給藥后96 h（d4）和恢復(fù)末期（d17），肉眼觀察肌肉刺激反應(yīng)并參照文獻(xiàn)［13］分級(jí)，同時(shí)進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查。

1.3.3 多次給藥肌肉刺激試驗(yàn) 分組、給藥體積和注射部位按照1.3.2項(xiàng)方法，分別在d0、d3、d7、d14和d28給藥1次，共5次。動(dòng)物分2次解剖檢查，每組首次各剖檢2只，雌雄各半；第二次剖檢余下動(dòng)物。兩次解剖時(shí)間分別為末次給藥后96 h（d4）和恢復(fù)末期（末次給藥后d17），肉眼觀察肌肉刺激反應(yīng)并參照文獻(xiàn)［13］分級(jí)，同時(shí)進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查。

1.3.4 單次給藥毒性 取SPF 級(jí)ICR 小鼠共60 只，稱重后按其性別和體質(zhì)量通過簡(jiǎn)單隨機(jī)化分配步驟分為3組，每組20只動(dòng)物，雌雄各半。

參考小鼠經(jīng)肌內(nèi)注射的最大給藥容量（10 mL/kg）及供試品最大給藥濃度設(shè)定本試驗(yàn)的高劑量，將高劑量的1/2 作為本試驗(yàn)的低劑量，即25 IU/kg 和50 IU/kg兩個(gè)劑量水平的給藥組，同時(shí)設(shè)置1個(gè)賦形劑對(duì)照組。對(duì)照組和50 IU/kg劑量組按10 mL/kg 的給藥體積，25 IU/kg 劑量組按照5 mL/kg 的給藥體積。左右后肢肌肉各選取1 個(gè)位點(diǎn)注射，兩個(gè)位點(diǎn)注射體積相同。單次給藥，觀察其臨床反應(yīng)，監(jiān)測(cè)體質(zhì)量、耗食量、大體解剖、臟器重量等指標(biāo)，并計(jì)算臟器重量與體質(zhì)量比值、臟器重量與腦重比值。

1.3.5 溶血性試驗(yàn) 制備兔血紅細(xì)胞用氯化鈉注射液配成2%體積分?jǐn)?shù)的混懸液，備用。

參照文獻(xiàn)方法［14］，設(shè)置供試品組為1-5 號(hào)管，陰性對(duì)照組為6 號(hào)管，陽性對(duì)照組為7 號(hào)管；另外增加8號(hào)管為賦形劑對(duì)照組。依次加入2%紅細(xì)胞懸液、氯化鈉注射液或去離子水、不同體積供試品，混勻后，立即置（37±1.0）℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫育3 h。期間觀察并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Office Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)分析，豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單次給藥毒性試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)比較采用One way ANOVA 檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)結(jié)果所有動(dòng)物均存活到激發(fā)前，分組當(dāng)日、首次致敏、末次致敏以及兩次激發(fā)當(dāng)日稱重結(jié)果表明，各組雌雄豚鼠體質(zhì)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。第14 天和第21 天激發(fā)結(jié)果見表1，2。從過敏反應(yīng)程度和發(fā)生率來看，除不含人血白蛋白的賦形劑組未見過敏反應(yīng)外，其余各組均發(fā)生不同程度的過敏癥狀，過敏發(fā)生率為100%。從豚鼠過敏病死率來看，第14 天或第21 天激發(fā)后，不含人血白蛋白的賦形劑對(duì)照組病死率均為0，含有人血白蛋白的賦形劑對(duì)照組病死率分別為0 和33.33%，低劑量組病死率分別為0 和50%，高劑量組病死率分別為16.67%和33.33%，上市對(duì)照組病死率分別為66.67%和83.33%，陽性對(duì)照組病死率均為100%。低劑量組、高劑量組和賦形劑對(duì)照組（含人血白蛋白）之間病死率比較，第14 天激發(fā)后組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.12，P=0.347），第21天激發(fā)后組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.47，P=0.792）。

表1 豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)結(jié)果（第14天激發(fā)）

2.2 單次給藥肌肉刺激試驗(yàn)結(jié)果賦形劑對(duì)照組和給藥組動(dòng)物注射部位在實(shí)驗(yàn)期間均未見異常，刺激反應(yīng)評(píng)分為0分（無明顯變化）。局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果如表3 所示，給藥后96 h（d4），給藥組可見1 只家兔給藥部位（左側(cè)股四頭?。┬≡钶p微單核細(xì)胞浸潤(rùn)；恢復(fù)末期（給藥后d17），動(dòng)物左右側(cè)股四頭肌均正常。

表2 豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)結(jié)果（第21天激發(fā)）

表3 單次給藥兔肌肉刺激試驗(yàn)局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.3 多次給藥肌肉刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果賦形劑對(duì)照組和給藥組注射部位肉眼觀察未見異常，刺激反應(yīng)評(píng)分為0分（無明顯變化）。局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果如表4 所示，末次給藥后96 h（d4），賦形劑對(duì)照組和給藥組各有2只家兔給藥部位出現(xiàn)輕度至中度單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)；恢復(fù)末期（末次給藥后d17），給藥組可見1只家兔給藥部位輕度單核細(xì)胞浸潤(rùn)。所有動(dòng)物右側(cè)股四頭肌（未給藥）正常。

表4 多次給藥兔肌肉刺激實(shí)驗(yàn)局部組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.4 單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)中未見動(dòng)物死亡或?yàn)l死，適應(yīng)期及觀察期均未見異常。給藥前、給藥當(dāng)日、給藥后1周和2周小鼠體質(zhì)量結(jié)果見表5，給藥前后小鼠體質(zhì)量增加；且高劑量組、低劑量組和賦形劑對(duì)照組之間，無論雌性或雄性小鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示疫苗未對(duì)體質(zhì)量增長(zhǎng)產(chǎn)生影響；耗食量、大體解剖、臟器重量、臟器重量與體質(zhì)量比以及臟器重量與腦重比，均未見與給予疫苗相關(guān)的異常變化。由此可見，兩個(gè)劑量水平的凍干人用狂犬病疫苗（MRC-5細(xì)胞）均沒有明顯的毒性反應(yīng)，疫苗最大耐受量（MTD）＞50 IU/kg。

表5 單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量變化（n=10）/（g，xˉ±s）

2.5 溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果孵育前，除陽性對(duì)照組顏色較紅有溶血現(xiàn)象外，其余各組試管內(nèi)紅細(xì)胞分布均勻；孵育期間，供試品、賦形劑對(duì)照和陰性對(duì)照組肉眼觀察可見紅細(xì)胞緩慢下沉，上清液體無色澄明；陽性對(duì)照組溶液顏色較紅，呈澄明紅色。孵育3 h 后，手動(dòng)顛倒搖勻各組試管，未見棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，無凝聚現(xiàn)象發(fā)生。

3 討論

臨床使用時(shí)，疫苗中由于含外源蛋白、明膠和抗生素等，或可導(dǎo)致嚴(yán)重過敏反應(yīng)［14-15］。狂犬病疫苗因?yàn)闅埩粲薪?jīng)過滅活處理的人血白蛋白，以及宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA 以及殘留的牛血清白蛋白等常常引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)和局部刺激反應(yīng)［14-17］。

疫苗保護(hù)劑中添加的人血白蛋白，因?yàn)榉N屬關(guān)系常會(huì)引起豚鼠過敏反應(yīng)，豚鼠主動(dòng)過敏實(shí)驗(yàn)常常無法完全排除狂犬病疫苗抗原和保護(hù)劑成分潛在的過敏風(fēng)險(xiǎn)［18］。通過設(shè)立不含抗原成分的對(duì)照組，比較過敏反應(yīng)程度和發(fā)生率，可以研究抗原成分是否會(huì)引起或加重過敏［19］。為此，本研究分別設(shè)置了兩種賦形劑對(duì)照組。研究結(jié)果顯示，疫苗組和上市對(duì)照組因在凍干保護(hù)劑中添加了人血白蛋白，從而引起豚鼠出現(xiàn)過敏反應(yīng)。不含人血白蛋白的賦形劑組過敏反應(yīng)呈現(xiàn)陰性，確認(rèn)該疫苗過敏反應(yīng)與賦形劑其他組分無關(guān)。含有人血白蛋白的賦形劑組、低劑量組、高劑量組疫苗三者相較，過敏反應(yīng)程度相似、過敏發(fā)生率均為100%；三組動(dòng)物病死率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此可以判斷過敏反應(yīng)與疫苗抗原成分無關(guān)。人血白蛋白不會(huì)引起人體過敏反應(yīng)，且疫苗中添加的人血白蛋白為市售的批簽發(fā)制品，效期滿足疫苗有效期，能夠保證人體內(nèi)使用時(shí)安全性。

考慮到現(xiàn)有“五針法”免疫程序可能在同一部位給藥5 針［20］，本研究同時(shí)設(shè)計(jì)了單次和多次給藥肌肉刺激實(shí)驗(yàn)。多次給藥肌肉刺激后，賦形劑組和給藥組均出現(xiàn)給藥側(cè)股四頭肌輕度至中度單核細(xì)胞浸潤(rùn)，該現(xiàn)象為常見的注射針穿刺造成的損傷以及機(jī)體對(duì)損傷的修復(fù)或反應(yīng)性變化。對(duì)照組和給藥組注射部位觀察以及局部組織病理學(xué)檢查均未見與疫苗相關(guān)的異常。

在本研究條件下，凍干人用狂犬病疫苗（MRC-5細(xì)胞）在豚鼠中引起的過敏癥狀，與疫苗抗原成分無關(guān)；單次和多次肌內(nèi)注射均不會(huì)引起家兔肌肉刺激性反應(yīng)；給藥最高劑量50 IU/kg 時(shí)，未見明顯的毒性反應(yīng)；疫苗自身也不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血和凝聚。

綜上所述，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，采用MRC-5 細(xì)胞制備的凍干人用狂犬病疫苗具有良好的安全性。