金肇權(quán)，張文彬，陳欣，朱濱

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種致病因素所導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，可造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，最終引起急性低氧性呼吸功能不全［1-2］。隨著病情進(jìn)一步惡化，ALI 常演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［3］，臨床癥狀主要表現(xiàn)為頑固性低氧血癥，具有較高的致死率［4］。ALI/ARDS 既是多種呼吸道重癥的發(fā)病基礎(chǔ)，又是全身炎癥活動(dòng)劇烈時(shí)較易出現(xiàn)的綜合征［5］。近年來(lái)，ALI/ARDS 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其影響因素已成為臨床研究熱點(diǎn)問(wèn)題。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是由脂質(zhì)和多糖所構(gòu)成的復(fù)合物，有研究表明，脂多糖常通過(guò)Toll 樣受體（toll-like receptors，TLR）家族參與機(jī)體炎性活動(dòng)和免疫反應(yīng)，與機(jī)體多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。另?yè)?jù)研究顯示，白細(xì)胞分化抗原14（leukocyte differentiation antigen 14，CD14）作為脂多糖受體，其主要生物學(xué)活性是識(shí)別、結(jié)合脂多糖復(fù)合物，參與、把控脂多糖性細(xì)胞反應(yīng)［7］；TLR4 作為T(mén)LR 家族的主要成員之一，是參與非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的主要蛋白質(zhì)因子［8］；而核因子激活的B 細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)（enhancement of kappa light chain in nuclear factor activated B cells，NF-κB）通過(guò)結(jié)合多種炎性細(xì)胞因子或腫瘤壞死因子，參與機(jī)體各種炎癥活動(dòng)，并與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。但目前臨床鮮有研究探討過(guò)CD14、TLR4、NF-κB 以及脂多糖等細(xì)胞因子在ALI/ARDS 發(fā)病中的作用，本次研究以此目標(biāo)為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)大鼠進(jìn)行ALI/ARDS 造模實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠90 只，8～10周，體質(zhì)量（187.52±5.16）g，購(gòu)買(mǎi)于北京寶元興業(yè)科技有限公司［SYXK（京）2020-0167］。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方法將90只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C 三組，每組各30 只。A 組和B 組大鼠在左側(cè)尾靜脈部位注射內(nèi)毒素9 mg/kg，制造大鼠ALI/ARDS 模型。C 組大鼠靜脈注射生理鹽水。給予A組大鼠CD14 模擬物、TLR4 模擬物以及NF-κB 模擬物靜脈注射。取大鼠肺組織，留取一半肺組織，4%甲醛溶液固定，用于病理染色；剩余組織置于液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。

1.3 儀器與試劑大鼠sEPCR 檢測(cè)試劑盒（上海信裕生物工程有限公司）；Trizol試劑（武漢科昊佳生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑［上海賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；血液分析儀（日本SYSMEX）及配套試劑檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)；全自動(dòng)生化分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；大鼠肺功能儀（北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司）；血?dú)怆娊赓|(zhì)分析儀（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.4 CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖樣本收集和檢測(cè)方法CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表達(dá)：采用蛋白質(zhì)印跡法。取部分梗阻側(cè)腎組織標(biāo)本，勻漿器充分研磨后加入裂解液裂解并提取總蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小配置適合濃度的凝膠、分離膠和濃縮膠。電泳加壓轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉1 h。加入特異性CD14 抗體、TLR4 抗體、NF-κB P65 抗體和脂多糖抗體，稀釋比例為1∶1 000，以β-actin（1∶5 000）作為對(duì)照。去除一抗，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，漂洗，化學(xué)發(fā)光法X 線(xiàn)片顯影，采用Image J 軟件得到條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 HE 染色（1）甲醛固定的肺組織采用石蠟包埋的方法制備成厚度5～7 μm 的石蠟病理切片，檢測(cè)時(shí)先行脫蠟水化，水化后的肺組織切片放入蘇木精水溶液中染色3 min。（2）流水沖洗掉多余的蘇木精，1%的鹽酸乙醇分化5～8 s，0.6%氨水返藍(lán)5～8 s。（3）流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻。（4）70%和90%乙醇中脫水各10 min。（5）乙醇伊紅染色液染色2～3 min。（6）染色后的切片經(jīng)純乙醇脫水，經(jīng)二甲苯使切片透明。（7）將已透明的切片滴上加拿大樹(shù)膠，蓋上蓋玻片封固。

1.6 觀察指標(biāo)（1）三組大鼠造模后呼吸頻率（respiratory rate，RR）、動(dòng)脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）：采用大鼠肺功能儀對(duì)大鼠RR 進(jìn)行檢測(cè)，于造模后采集大鼠動(dòng)脈血5 mL，并采用血?dú)怆娊赓|(zhì)分析儀對(duì)其PaO2進(jìn)行分析；（2）三組大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表達(dá)水平；（3）三組大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白相關(guān)性；（4）HE 染色結(jié)果；（5）肺組織損傷Murray 評(píng)分［10］：主要根據(jù)低氧血癥評(píng)分、呼氣末正壓及肺順應(yīng)性等指標(biāo)，各項(xiàng)評(píng)分均為0～4 分。肺組織損傷評(píng)分為四項(xiàng)結(jié)果評(píng)分相累加。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 系統(tǒng)軟件分析，其中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，三組間比較采用方差檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者進(jìn)一步采用事后LSD-t檢驗(yàn)分析兩兩間差異；Pearson 相關(guān)系數(shù)分析CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白和脂多糖蛋白的相關(guān)性，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模后RR、PaO2分析造模12 h 后，在三組大鼠的RR方面：A組＞B組＞C組，組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；而在PaO2方面：A 組＜B 組＜C 組，各組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 90只大鼠造模12 h后的RR與PaO2比較/

表1 90只大鼠造模12 h后的RR與PaO2比較/

注：RR為呼吸頻率，PaO2為血氧分壓。①與A組比較，P＜0.001。②與B組比較，P＜0.001。

2.2 三組大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖蛋白表達(dá)對(duì)比CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白和脂多糖蛋白表達(dá)方面：A 組＞B 組＞C 組，任意兩組間的均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），見(jiàn)表2。

表2 90只大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白表達(dá)對(duì)比/

表2 90只大鼠的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白表達(dá)對(duì)比/

注：CD14 為白細(xì)胞分化抗原14，TLR4 為趨化因子受體4，NFκB P65為核因子-κB P65。①與A組比較，P＜0.001。②與B組比較，P＜0.001。

2.3 A 組大鼠實(shí)驗(yàn)后的CD14、TLR4、NF-κB P65和脂多糖蛋白相關(guān)性研究Pearson 相關(guān)性分析顯示，A 組大鼠的脂多糖蛋白分別與CD14 蛋白、TLR4蛋白以及NF-κB P65 蛋白均呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖1。

圖1 急性肺損傷大鼠各蛋白與脂多糖蛋白（LPS）相關(guān)性：A為白細(xì)胞分化抗原14（CD14）蛋白；B為趨化因子受體4（TLR4）蛋白；C為核因子-κB（NF-κB P65）蛋白

表3 急性肺損傷大鼠實(shí)驗(yàn)后的白細(xì)胞分化抗原14（CD14）、趨化因子受體4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB P65）和脂多糖蛋白相關(guān)性研究

2.4 HE 染色圖光鏡下可見(jiàn)C 組大鼠肺組織切片肺泡結(jié)構(gòu)較為清楚，未發(fā)生炎性細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)。B組大鼠可見(jiàn)較為明顯的肺灶性出血，肺泡和肺間質(zhì)水腫，并且存在較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。A 組大鼠可見(jiàn)肺灶性出血、肺泡和肺間質(zhì)水腫以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況較B組更為嚴(yán)重。

2.5 肺組織損傷評(píng)分肺組織損傷評(píng)分方面：A 組為（14.73±0.52）分，B 組為（9.54±0.37）分，C 組為（5.38±0.07）分，且A＞B＞C，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=479.13，P=0.001），B 組與A 組、C 組比較，均P＜0.001。

3 討論

ALI/ARDS 是臨床上較為常見(jiàn)的肺部危重癥之一，具有一定的致死率［11］。近年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加速，社會(huì)工業(yè)化的不斷發(fā)展以及空氣污染的日益嚴(yán)峻，ALI/ARDS 發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)［12］。ALI/ARDS 作為一種臨床綜合征，好發(fā)于創(chuàng)傷、休克和感染等病人中，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為呼吸窘迫以及頑固性低氧血癥［13］。目前，臨床治療方案主要包括藥物療法配合氧療、機(jī)械通氣等對(duì)ALI/ARDS 病人進(jìn)行治療，但部分病人因病情較重或治療方式不當(dāng)，治療效果較差［14］。但目前臨床關(guān)于影響ALI/ARDS 發(fā)生發(fā)展因素及其作用機(jī)制尚未明確，而相關(guān)研究表明炎癥反應(yīng)可能是影響ALI/ARDS 發(fā)病的重要因素之一［3］。本研究對(duì)大鼠進(jìn)行ALI/ARDS 模型培養(yǎng)，并給予部分ALI/ARDS 模型大鼠CD14 模擬物、TLR4 模擬物以及NF-κB 模擬物靜脈注射，旨在觀察CD14-TLR4-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路在脂多糖誘導(dǎo)ALI/ARDS中作用及機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，ALI/ARDS 模型組大鼠造模后的RR 明顯高于正常組大鼠，而PaO2則明顯低于正常組大鼠，尤其是經(jīng)模擬物轉(zhuǎn)染組大鼠，其變化幅度進(jìn)一步擴(kuò)大，這與武昊天等［15］研究結(jié)果相一致。RR 是指單位時(shí)間內(nèi)的呼吸次數(shù)，其呼吸頻率明顯加快表明機(jī)體出現(xiàn)呼吸窘迫現(xiàn)象，是ALI/ARDS 等肺部疾病的主要癥狀之一［16］。PaO2即動(dòng)脈血中氧分子物理溶解時(shí)出現(xiàn)的張力，主要反映了機(jī)體是否缺氧以及缺氧的程度。PaO2明顯降低在一定程度上反映了機(jī)體存在缺氧狀況，同樣是ALI/ARDS等肺部疾病的常見(jiàn)臨床癥狀［17］。因此，研究結(jié)果表明了大鼠ALI/ARDS 造模成功，而經(jīng)CD14 模擬物、TLR4 模擬物以及NF-κB 模擬物轉(zhuǎn)染后，大鼠病變程度進(jìn)一步加重，反映了這3 項(xiàng)因子對(duì)大鼠機(jī)體炎性活動(dòng)和ALI/ARDS病情惡化的促進(jìn)作用。CD14作為脂多糖的受體，由糖蛋白構(gòu)成，能夠識(shí)別、結(jié)合脂多糖，還可作為革蘭陰性或陽(yáng)性細(xì)菌等其他產(chǎn)物的受體，在炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中均具有重要作用。TLR4作為T(mén)LR4家族的主要成員之一，對(duì)獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)具有調(diào)控作用，其活化后將激活機(jī)體抗微生物防御系統(tǒng)，產(chǎn)生IL-6 和TNF以及趨化型細(xì)胞因子，并最終參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。NF-κB P65 作為NF-κB 家族重要一員，參與細(xì)胞對(duì)外界刺激的響應(yīng)，如細(xì)胞因子、輻射、重金屬、病毒等，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中均起到關(guān)鍵作用。Ness T 等［18］在研究中發(fā)現(xiàn)，CD14-TLR4-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等密切相關(guān)，本研究結(jié)果表明增強(qiáng)CD14-TLR4-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠加劇ALI/ARDS 模型大鼠的病情惡化程度。

本研究對(duì)造模后三組大鼠的CD14、TLR4、NFκB P65 和脂多糖蛋白表達(dá)做出比較，結(jié)果顯示，大鼠ALI/ARDS 造模后，其CD14、TLR4、NF-κB P65 和脂多糖的蛋白表達(dá)均明顯上升，尤其是給予模擬物注射組模型大鼠，其變化幅度更大，這與Wu 等［19］學(xué)者的研究結(jié)果相一致。本研究還對(duì)模擬物注射組模型大鼠的脂多糖蛋白與CD14 蛋白、TLR4 蛋白、NF-κB P65 蛋白的相關(guān)性作出探討，結(jié)果顯示均呈正相關(guān)。脂多糖主要由多糖和脂質(zhì)構(gòu)成，脂多糖主要通過(guò)誘導(dǎo)存在于目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中的TLR4 來(lái)表現(xiàn)其作用［20］。TLR4 與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白共同作用捕獲脂多糖，并將其然后將其輸送給CD14 和NFκB P65 分子，最終作用于機(jī)體炎癥活動(dòng)與免疫反應(yīng)［21］。研究結(jié)果說(shuō)明，增強(qiáng)CD14-TLR4-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠通過(guò)誘導(dǎo)脂多糖類(lèi)因子的表達(dá)上升，并最終加快機(jī)體ALI/ARDS 病情發(fā)展與惡化。本研究還對(duì)三組大鼠造模后的肺組織切片進(jìn)行染色，結(jié)果顯示經(jīng)模擬物轉(zhuǎn)染后，其肺灶性出血、肺泡和肺間質(zhì)水腫以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況較普通ALI/ARDS模型組大鼠更為嚴(yán)重，而其肺組織損傷程度也更為嚴(yán)重。上述研究結(jié)果說(shuō)明經(jīng)模擬物轉(zhuǎn)染后，大鼠的ALI/ARDS相關(guān)炎性活動(dòng)更加顯著。

綜上所述，CD14-TLR4-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠增強(qiáng)脂多糖表達(dá)并促進(jìn)機(jī)體的炎性活動(dòng)，參與ALI/ARDS 的發(fā)生、發(fā)展。本研究尚存在一些不足之處，本研究?jī)H對(duì)CD14-TLR4-NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路在大鼠ALI/ARDS 中作用及機(jī)制進(jìn)行了探討，未來(lái)的研究中可以取手術(shù)治療的ALI/ARDS 病人的病變肺組織切片進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察其轉(zhuǎn)染后病變情況，以便更好地為臨床提供依據(jù)。