彭銀花，趙曄，彭巍，程曉燕，袁曉清，唐建清，龔輝

在中國，癌癥發(fā)病率正呈逐年上升及年輕化趨勢(shì)，腹水也是最常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量，因此探究對(duì)腹水相關(guān)事件的治療意義重大［1-2］。中醫(yī)理論認(rèn)為，惡性腹水治療以溫陽利水、散寒通滯為本，因肺主宣發(fā)肅降，脾主制水，腎主水，治以宣肺，實(shí)脾，溫腎利水，而同調(diào)肺脾腎［3-4］。消水散以十棗湯為基礎(chǔ)，具有瀉下、逐水、消腹脹喘滿、二便不利等功效，臨床常用于滲出性腦膜炎、肝硬化、結(jié)核性胸膜炎等所致胸腔積液、腹水或全身水腫等疾病。本課題組前期亦對(duì)消水散治療胃癌及腹水展開了多年研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗惡性腹水、抑制瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)T 細(xì)胞增殖活性等作用［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤生成、生長及轉(zhuǎn)移與病人先天性免疫缺陷或后天免疫失調(diào)及“免疫抑制”等狀態(tài)密切相關(guān)［7-8］。而腫瘤性惡性腹水形成是否亦與腹腔微環(huán)境中存在這種免疫抑制狀態(tài)有關(guān)，其與免疫細(xì)胞的相關(guān)性及相應(yīng)的分子機(jī)制又是什么，尚未可知。因此，擬研究消水散對(duì)人胃癌小鼠腹膜移植導(dǎo)致的陽虛型惡性腹水模型的治療作用及對(duì)腹水微環(huán)境的影響，以期揭示其作用機(jī)制，為后續(xù)腹水的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及主要儀器研究進(jìn)行時(shí)間為2019年4月至2020年5月。60只同系基因型雌性SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，近交系，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司［生產(chǎn)許可證編號(hào)SCXK（湘）2019-0004］，飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室［使用許可證編號(hào)SYXK（湘）2020-0008］。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。飼養(yǎng)溫度20～25°C，濕度50%～70%。人胃癌細(xì)胞株MGC803，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；FBS 購自美國Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)液購自美國HyClone 公司；B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD28、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）抗體及二抗同型對(duì)照IgG 均購自美國Invitrogen 公司；Prime-Script ?RT reagent Kit（Perfect Real Time）、TB Green? Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）均購自TaKaRa 生物公司；淋巴細(xì)胞分離液購自上海愛必信生物科技有限公司；小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA 試劑盒購自英國Abcam公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；醫(yī)用X線診斷系統(tǒng)購自德國SIEMENS公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；FACS-Calibur流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dikinson公司等。

1.2 消水散配置將消水散生藥方打粉，用雙蒸水（使用量為1 倍體積）浸泡2 h，收集藥液于70 ℃水浴中蒸發(fā)濃縮，定容為100 mL，4 000 r/min，離心15 min 以去掉大顆粒雜質(zhì)，取上清液濃縮至含生藥1.0 g/mL 的50 mL，過濾后留藥液，高溫高壓滅菌，0.22 μm 微孔濾器過濾除菌后，用10 mL離心管分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人胃癌熒光細(xì)胞株MGC803 的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)熒光標(biāo)記的胃癌細(xì)胞系MGC803 是從惡性腹水灶中分離的細(xì)胞，具有腹腔種植的特性。常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS 和G-418（0.75 g/L，用于篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光的細(xì)胞）的DMEM 培養(yǎng)液中，置于二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長期的MGC803 細(xì)胞株以0.25%胰酶消化，DMEM 培養(yǎng)液終止消化后，制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心4 min 后重懸于PBS 中。用錐蟲藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率＞98%。

1.4 造模及分組造模前1 周將人胃癌細(xì)胞株MGC803 進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，造模當(dāng)天對(duì)培養(yǎng)瓶中貼壁生長的細(xì)胞用胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，離心后將沉淀細(xì)胞用PBS 液洗2 遍后計(jì)數(shù)，配制成2×107/mL 的細(xì)胞懸液，造模前置于冰上備用。造模開始，首先按200 mg·kg-1·d-1劑量將腺嘌呤制成混懸液0.2 mL，定時(shí)、定量、定人給小鼠灌胃，每日1 次，連續(xù)21 d。小鼠逐漸出現(xiàn)畏寒喜暖、反應(yīng)遲鈍、蜷縮、拱背、消瘦、多尿、大便稀溏、少食、少動(dòng)萎靡等現(xiàn)象，類似“陽虛”狀態(tài)，隨機(jī)取10只陽虛模型，眼球取血檢測腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)醇（CORT）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺激素（TSH）含量明顯低于正常小鼠（P＜0.05），表示陽虛模型建立成功。陽虛小鼠麻醉后，75%乙醇前胸壁消毒，用手觸及心尖搏動(dòng)最明顯處，約于胸骨左旁3 mm 第二肋間，瞄準(zhǔn)正中垂直進(jìn)針，深度約0.5 cm，進(jìn)針角度與小鼠腹面正中線呈45°，與皮膚呈30°。緩慢回抽，若能看到有鮮紅的血液抽出，則表示針已進(jìn)入左心室，將MGC803細(xì)胞懸液0.2 mL（0.4×106個(gè)胃癌細(xì)胞）慢慢推入后，迅速拔針，用棉球稍壓針孔少許，接種完成。建模后在X線片下觀察腹水的出現(xiàn)并行體表標(biāo)記。

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、模型組、消水散低劑量組、消水散中劑量組、消水散高劑量組，每組10 只。以消水散臨床劑量為低劑量，消水散低、中、高劑量組分別于造模后第2 天給藥7.8 g·kg-1·d-1、15.6 g·kg-1·d-1、23.4 g·kg-1·d-1，每天分2次給藥，連續(xù)30 d。

1.5 行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組小鼠精神狀況，從陽虛造模第二周開始，參照相關(guān)文獻(xiàn)［9］及陽虛證小鼠癥狀量化積分表，評(píng)價(jià)各組小鼠陽虛癥狀積分，見表1。

表1 陽虛證小鼠癥狀量化積分表

1.6 ACTH、CORT、T3、T4、TSH 含量測定隨機(jī)抽取10 只陽虛小鼠，小鼠用5%水合氯醛100 μL 進(jìn)行腹腔麻醉后固定頭部，并輕輕向下壓迫頸部兩側(cè)造成頭部靜脈血液回流困難，使眼球充分外突，摘眼球取血，電化學(xué)發(fā)光法檢測促ACTH、CORT、T3、T4、TSH含量，評(píng)估陽虛模型質(zhì)量。

1.7 腹腔X 線攝片觀察腹水腹腔內(nèi)注射后的第15、22、31 天，經(jīng)10%水合氯醛麻醉，在X 線下攝像觀察腹水生長情況。并于第31 天統(tǒng)計(jì)腹水量。無菌條件下開腹，無菌吸管收集腹水于離心管中，計(jì)算腹水平均體積。

1.8 測定原位瘤體積及稱重用游標(biāo)卡尺量取原位腫瘤長寬徑及高度，根據(jù)腫瘤體積計(jì)算方法V=πabc/6（a 為長徑，b 為寬徑，c 為高）計(jì)算出原位腫瘤體積。給藥結(jié)束處死小鼠后剝?nèi)≡涣龇Q質(zhì)量。

1.9 循環(huán)血液中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4含量測定各組小鼠摘眼球取血抗凝，添加淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），PBS洗滌后分別添加純化的單克隆抗體B7-1、B7-2、CD28、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）各10 μL，充分混勻后置于4 ℃冰箱孵育45 min，洗滌細(xì)胞后離心棄上清，分別添加各自FITC 標(biāo)記的熒光二抗20 μL，4 ℃冰箱避光孵育30 min，離心棄上清，添加200 μL稀釋液，采用流式細(xì)胞儀檢測B7-1、B7-2、CD28 及CTLA-4表達(dá)水平。

1.10 腹膜組織中B7-1、B7-2、CD28 及CTLA-4 mRNA 水平檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，無菌環(huán)境下抽取腹水，并剝離小鼠皮膚，分離周圍組織，然后將小鼠腹膜游離后去除附著肌肉組織，置于液氮保存?zhèn)溆?。提取腹膜組織總RNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）擴(kuò)增B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4 mRNA目的片段。20 μL反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，正反向引物（10 μM）各0.8 μL，雙蒸水6.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s；95℃、5 s；61℃、31 s，40 個(gè)循環(huán)。B7-1、B7-2、CD28 及CTLA-4 及內(nèi)參GAPDH 引物序列見表2。采用2-ΔΔCt法定量分析腹膜組織中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表2 RT-qPCR引物

1.11 腹膜組織中TGF-β1、IL-10 表達(dá)水平檢測以1∶10 制備腹膜組織勻漿液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測腹膜組織中TGF-β1、IL-10表達(dá)水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用成組t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠陽虛癥狀積分、血清ACTH、CORT、T3、T4、TSH 含量比較體質(zhì)特性能夠通過相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)呈現(xiàn)，陽虛癥小鼠的下丘腦-垂體-腎上腺軸呈抑制狀態(tài)，主要表現(xiàn)為ACTH、CORT 含量的下降；下丘腦-垂體-甲狀腺軸亦呈抑制狀態(tài)，主要表現(xiàn)為T3、T4、TSH 含量的下降。本研究結(jié)果顯示與正常小鼠比較，模型小鼠陽虛癥狀積分顯著增加，血清ACTH、CORT、T3、T4、TSH 含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 小鼠陽虛癥狀積分、血清ACTH、CORT、T3、T4、TSH含量比較/

表3 小鼠陽虛癥狀積分、血清ACTH、CORT、T3、T4、TSH含量比較/

注：ACTH為腎上腺皮質(zhì)激素，CORT為皮質(zhì)醇，T3為三碘甲狀腺原氨酸，T4為甲狀腺素，TSH為促甲狀腺激素。

2.2 各組小鼠腹水量、瘤體積及瘤重比較與模型組比較，消水散低、中、高劑量組小鼠腹水量、瘤體積、瘤重依次減少（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠腹水量、瘤體積及瘤重比較/

表4 各組小鼠腹水量、瘤體積及瘤重比較/

注：①模型組比較，P＜0.05。②與消水散低劑量組比較，P＜0.05。③與消水散中劑量組比較，P＜0.05。

2.3 各組小鼠腹膜組織中TGF-β1、IL-10表達(dá)水平比較與模型組比較，消水散低、中、高劑量組小鼠腹膜組織中TGF-β1、IL-10 表達(dá)水平依次降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠腹膜組織中TGF-β1、IL-10表達(dá)水平比較/（pg/g，）

表5 各組小鼠腹膜組織中TGF-β1、IL-10表達(dá)水平比較/（pg/g，）

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子β1，IL-10為白細(xì)胞介素10。①與模型組比較，P＜0.05。②與消水散低劑量組比較，P＜0.05。③與消水散中劑量組比較，P＜0.05。

2.4 各組小鼠循環(huán)血液中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4 含量比較治療癌性腹水需增強(qiáng)T 細(xì)胞免疫活性，B7-1 和B7-2 表達(dá)于活化的抗原遞呈細(xì)胞表面，該細(xì)胞參與T 細(xì)胞的激活。CTLA-4 可以與CD28 競爭結(jié)合B7-1 和B7-2，阻斷CD28 的T 細(xì)胞激活通路。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，消水散低、中、高劑量組小鼠循環(huán)血液中B7-1、B7-2、CD28含量依次增加，CTLA-4 含量依次降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組小鼠循環(huán)血液中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4含量比較/

表6 各組小鼠循環(huán)血液中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4含量比較/

注：CTLA-4為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4。①與模型組比較，P＜0.05。②與消水散低劑量組比較，P＜0.05。③與消水散中劑量組比較，P＜0.05。

2.5 各組小鼠腹膜組織中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4 mRNA 水平比較與模型組比較，消水散低、中、高劑量組小鼠腹膜組織中B7-1、B7-2、CD28 mRNA 依次增加，CTLA-4 mRNA 依次降低（P＜0.05），見表7。

表7 各組小鼠腹膜組織中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4 mRNA比較/

表7 各組小鼠腹膜組織中B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4 mRNA比較/

注：CTLA-4為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4。①與模型組比較，P＜0.05。②與消水散低劑量組比較，P＜0.05。③與消水散中劑量組比較，P＜0.05。

3 討論

腹水屬中醫(yī)“臌脹”范疇，病位在氣血，病機(jī)根本為肝脾腎失調(diào)，氣滯血結(jié)，水停腹中?！瓣枤馐в诜蟛迹幒靡阅邸笔悄[瘤的基本病因病機(jī)［10-11］。因此本研究首先通過給小鼠灌胃腺嘌呤制備陽虛模型，結(jié)果顯示，陽虛癥狀積分顯著增加，血清ACTH、CORT、T3、T4、TSH 含量顯著降低，提示陽虛小鼠制備成功［12］。進(jìn)一步對(duì)陽虛小鼠進(jìn)行人胃癌細(xì)胞株MGC803腹腔注射制備陽虛胃癌性惡性腹水模型，造模31 d 后發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腹圍增大，腹水量顯著增加，提示胃癌性腹水模型制備成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。臨床治療癌性腹水主要以扶正為本，即通過“扶正（溫陽）”可達(dá)到“驅(qū)邪（散寒）”之功，通過改善腹腔免疫失常微環(huán)境，以提高腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）、調(diào)節(jié)病人免疫平衡的功能，達(dá)到抗惡性腫瘤細(xì)胞消水的作用。消水散全方：芫花（熬）、甘遂、大戟各等分取1 g，大棗10 g、螻蛄10 g、蟋蟀10 g、腹水草9 g、蜣螂10 g。本方以十棗湯為基礎(chǔ)，主治懸飲，咳唾胸脅引痛，心下痞硬，干嘔短氣，頭痛目眩，胸背掣痛不得息，舌苔白滑，脈沉弦；還具有攻逐水飲、消腫、利便之功效。另加入螻蛄10 g、蟋蟀10 g、腹水草9 g、蜣螂10 g 加強(qiáng)消水之效果，療效顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道，溫陽消水方外敷后可緩解癌性腹水方面，與西藥利尿劑臨床療效相當(dāng)，同時(shí)可減少因反復(fù)利尿造成病人耐藥情況及電解質(zhì)紊亂的風(fēng)險(xiǎn)，提高癌性腹水病人生活質(zhì)量［13］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，陽虛寒凝為惡性腹水瘤常見癥候之一。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，消水散可呈劑量依賴性降低小鼠腹水量、移植瘤體積及質(zhì)量，與文獻(xiàn)報(bào)道及前期結(jié)果一致，提示消水散可有效治療移植性惡性腹水，抑制移植瘤生長。

中醫(yī)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，“正虛（陽虛）”是腫瘤發(fā)生發(fā)展之根本，癌毒侵襲為“病邪之本”，“陽化氣，陰成形”，正邪相互抗?fàn)帲瑢?dǎo)致腫瘤發(fā)病。邪毒不斷壯大，又會(huì)加重正氣虧虛，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供條件［14-15］。西醫(yī)Paget 經(jīng)典的“種子與土壤”學(xué)說與中醫(yī)“正虛”理論不謀而合，即癌毒作為種子的惡性腫瘤細(xì)胞侵襲機(jī)體是發(fā)病外因，造成陽虛形成及腹腔微環(huán)境中形成的免疫抑制狀態(tài)，加重疾病進(jìn)展［16］。近來中藥治療癌性腹水研究表明，改善病人免疫功能抑制狀態(tài)、喚醒T 細(xì)胞免疫活性對(duì)改善腫瘤病人預(yù)后及療效至關(guān)重要［17］。B7 是免疫球蛋白超家族成員，以B7-1（CD80）、B7-2（CD86）兩種單體形式表達(dá)于多種活化的抗原遞呈細(xì)胞表面，該細(xì)胞參與T 細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子及抗體等過程。CTLA-4 與CD28 競爭結(jié)合B7 家族分子，阻斷CD28 與B7 的信號(hào)傳導(dǎo)通路，防止CD28 分子促進(jìn)T細(xì)胞激活。近來隨著對(duì)B7/CD28/CTLA-4 共刺激途徑的研究不斷深入，大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抗CTLA-4 可有效用于腫瘤的靶向治療［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消水散可呈劑量依賴性增加B7-1、B7-2 及CD28 表達(dá)，降低CTLA-4 表達(dá)，提示消水散可能通過抑制CTLA-4表達(dá)，緩解免疫抑制狀態(tài)，改善人胃癌腹膜移植小鼠惡性腹水，抑制移植瘤生長。另有研究顯示，免疫逃逸是通過促進(jìn)Treg 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10 表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展［19-20］。為探究消水散對(duì)腹腔免疫微環(huán)境的作用，本研究進(jìn)一步檢測腹膜組織中TGF-β1、IL-10 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消水散可呈劑量依賴性降低惡性腹水小鼠腹膜組織中TGF-β1、IL-10 表達(dá)，提示消水散可能通過抑制CTLA-4 表達(dá)，抑制其對(duì)Treg 細(xì)胞的趨化作用，對(duì)抗惡性腹水、改善機(jī)體免疫微環(huán)境，發(fā)揮抗腫瘤作用。