孔裕琴

摘要：從西寧市5個(gè)市場(chǎng)采集魚、蝦各30份樣品，通過常規(guī)的細(xì)菌分離技術(shù)分離到副溶血弧菌6株，其平均檢出率為10%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離所得副溶血弧菌對(duì)卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明等出現(xiàn)高度敏感;對(duì)頭孢拉啶、頭孢唑啉出現(xiàn)中度敏感;對(duì)氨芐西林、青霉素不敏感。

關(guān)鍵詞：海產(chǎn)品;副溶血弧菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS201? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus， VP）屬于弧菌科，弧菌屬，從1950年日本的一次暴發(fā)性食物中毒中分離得到此菌[1]。菌體具多形性，可為弧狀、桿狀或絲狀。一端有鞭毛，無(wú)芽孢，革蘭氏染色為陰性。菌落中等大小，培養(yǎng)24小時(shí)直徑約為2 mm。嗜鹽，可在含7.5% NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最為適宜，在無(wú)鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很差甚至不能生長(zhǎng)[2]，在弧菌選擇性培養(yǎng)基TCBS瓊脂平板上，因該菌不分解蔗糖，所以指示劑不變色，菌落呈現(xiàn)為藍(lán)綠色，這是利用了不發(fā)酵蔗糖的原理[3]。副溶血弧菌是普遍存在于海產(chǎn)品中的一種人類和動(dòng)物共有的病原菌[4]，該菌不僅能給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失，而且會(huì)引起水生動(dòng)物疾病的發(fā)生，同時(shí)也是引起人類食源性疾病的重要病原菌之一。

為了了解當(dāng)前市場(chǎng)上銷售的海產(chǎn)品中細(xì)菌的污染程度，本試驗(yàn)共采集了西寧市市售的部分海產(chǎn)品中的30份魚樣，30份蝦樣，應(yīng)用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定技術(shù)對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行分離與鑒定。以期為今后食源性病原菌的分離培養(yǎng)鑒定提供一定的參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1? 材料

1.1? 樣品來(lái)源

采集西寧市莫家街市場(chǎng)、朝陽(yáng)市場(chǎng)、水井巷市場(chǎng)、城南新區(qū)市場(chǎng)、八一路市場(chǎng)5個(gè)水產(chǎn)市場(chǎng)的魚樣30份，蝦樣30份（每個(gè)市場(chǎng)6份魚樣、6份蝦樣），共計(jì)60份，置于密封袋內(nèi)，根據(jù)來(lái)自市場(chǎng)和樣品種類的不同分別用字母MJx、MJy、CYx、CYy、SJx、SJy、CNx、CNy、BYx、BYy等標(biāo)記分開。并帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 培養(yǎng)基

堿性蛋白胨水（BP）;TCBS平板培養(yǎng)基、MH平板培養(yǎng)基。

1.3? 藥敏紙片

β-內(nèi)酰胺類：青霉素、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢拉啶;氨基糖苷類：慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素;喹諾酮類：萘啶酸、環(huán)丙沙星;磺胺類：復(fù)方新諾明。購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，批號(hào)為910709。

1.4? 診斷血清

副溶血弧菌O抗原診斷血清：副溶血弧菌O抗原的多價(jià)診斷血清O1-O13，副溶血弧菌O抗原的單價(jià)診斷血清O1-O13。購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司。生產(chǎn)批號(hào)為20130703。

2? 方法

2.1? 樣品處理及增菌

將每個(gè)市場(chǎng)采集的魚以無(wú)菌操作分別從頭、背、尾不同部位各剪取2～3 g樣品，并剪碎置于裝有堿性蛋白胨水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)。將蝦去皮后剪碎，置于裝有堿性蛋白胨水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)。30個(gè)滅菌錐形瓶裝魚樣（編號(hào)分別為MJy1…MJy6，CYy7…CYy12，SJy13…SJy18，CNy19…CNy24，BYy25…BYy30），30個(gè)滅菌錐形瓶裝蝦樣（編號(hào)分別為MJx1…MJx6，CYx7…CYx12，SJx13…SJx18，CNx19…CNx24，BYx25…BYx30）。共計(jì)60個(gè)滅菌錐形瓶，置于35℃溫箱增菌培養(yǎng)18～24小時(shí)。

2.2? 分離培養(yǎng)

取增菌液，用接種環(huán)勾取1-2環(huán)接種到TCBS瓊脂平板上（編號(hào)為X1，X2，X3…X30;Y1，Y2，Y3…Y30），于35℃溫箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)后觀察結(jié)果。

2.3? 涂片鏡檢

對(duì)培養(yǎng)后的平板仔細(xì)觀察，并挑取平板上的可疑菌落，然后用接種環(huán)勾取單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并記錄結(jié)果。

2.4? 血清型鑒定

取培養(yǎng)了18～24小時(shí)后的培養(yǎng)物，然后用3%食鹽水作成比較濃的菌懸液，通過121℃高壓1小時(shí)或100℃煮沸后，用該菌懸液進(jìn)行O抗原血清玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)選用無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照組，30 s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為“陽(yáng)性”反應(yīng)，反之為“陰性”反應(yīng)。同時(shí)，以凝集抗原和5 g/L生理鹽水混合物作對(duì)照。若發(fā)生凝集再用副溶血弧菌單價(jià)血清逐一做凝集反應(yīng)，鑒定血清型。

2.5? 藥敏試驗(yàn)

采用WHO推薦的Kriby-Bauer（K-B）法，判定標(biāo)準(zhǔn)是參照美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）藥敏紙片擴(kuò)散法法規(guī)進(jìn)行判定?？股厮幬锓N類共有10種，環(huán)丙沙星、氨芐西林、慶大霉素、妥布霉素、萘啶酸、頭孢拉啶、卡那霉素、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、青霉素。具體方法為：選擇編號(hào)為X5、X23、Y24、Y29、Y20、Y28共6株菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離所得的副溶血弧菌的純培養(yǎng)物稀釋至5×107～5×108 cfu/mL，用滅菌棉拭子將菌液均勻涂布于約4 mm厚的MH平板表面，使平板干燥3～5分鐘，然后分別貼上藥敏紙片，在35℃溫箱培養(yǎng)18～24小后觀察測(cè)量并記錄結(jié)果。

3? 結(jié)果

3.1? 菌落特征

經(jīng)過35℃下培養(yǎng)18～24小時(shí)后，在TCBS平板上可見呈圓形，濕潤(rùn)，稍混濁，半透明，中心略隆起，邊緣整齊，中等大小的藍(lán)綠色菌落生長(zhǎng)。

3.2? 涂片鏡檢

通過細(xì)菌培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色后，在油鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)分離菌為革蘭氏陰性，呈現(xiàn)桿狀、絲狀或弧狀多種形態(tài)。

3.3? 血清型鑒定

X5、X23、Y24、Y29、Y20、Y28 共6株菌株，其中X5血清型為O4，X23血清型為O6;Y20、Y28分別為O2和O11;Y24、Y29未鑒定出血清型。

3.4? 藥敏試驗(yàn)

在藥敏試驗(yàn)中，所分離到的菌株對(duì)環(huán)丙沙星、萘啶酸、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)出高度敏感， 對(duì)頭孢拉啶、頭孢唑啉出現(xiàn)中度敏感，對(duì)氨芐西林、青霉素出現(xiàn)耐藥。具體結(jié)果見表1。

4? 討論

（1）本試驗(yàn)中共選用60份樣品：30份魚樣、30份蝦樣。經(jīng)分離鑒定，生化試驗(yàn)，血清型鑒定，藥敏試驗(yàn)，最終分離出副溶血弧菌6株，檢出率為10%，其中蝦的檢出率為3.3%，魚的檢出率為6.7%，說明副溶血弧菌在魚上的攜帶率較高;城南市場(chǎng)的檢出率為5%，八一路市場(chǎng)的檢出率為3.3%;莫家街市場(chǎng)的檢出率為1.7%，由結(jié)果顯示城南市場(chǎng)的檢出率最高。因此，要引起人們的高度重視，加強(qiáng)食品衛(wèi)生的管理，嚴(yán)防病從口入。

（2）通過藥敏試驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)氨基糖苷類抗生素中的卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素，喹諾酮類抗生素中的萘啶酸、環(huán)丙沙星，磺胺類抗生素中的復(fù)方新諾明出現(xiàn)高度敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的氨芐西林、青霉素不敏感，對(duì)頭孢唑啉、頭孢拉啶中度敏感。從現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的氨芐西林和阿莫西林都產(chǎn)生不同程度的耐藥性，就在早期使用的抗生素如第一和第二代頭孢菌素類藥物都出現(xiàn)高度耐受作用[6]，β-內(nèi)酰胺類抗生素具有抗菌活性強(qiáng)、毒性低、種類多及適應(yīng)癥廣等特性，其抗菌作用機(jī)理均為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成?？梢?，副溶血弧菌的耐藥性是十分嚴(yán)重的。

（3）食品安全領(lǐng)域存在的問題主要表現(xiàn)在以下三個(gè)方面：①由微生物造成的食源性疾病;②水域的污染、化學(xué)性危害、抗生素及重金屬等殘留;③食品出口受阻、食品安全標(biāo)準(zhǔn)落后于生產(chǎn)和不同企業(yè)及不同地區(qū)的發(fā)展仍然存在巨大的差異，非法生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的食品和其他問題?？傊?，要加強(qiáng)對(duì)食品的安全管理，杜絕任何食品的安全問題，形成健康食品、健康生活的社會(huì)環(huán)境。

參考文獻(xiàn)

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