陳映群，張衛(wèi)星，李 智

高尿酸已經(jīng)被證實(shí)與心血管疾病密切相關(guān)，包括高血壓、缺血性心臟病、心力衰竭和心源性猝死等[1-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高尿酸可加重缺血/缺氧條件下小鼠心肌細(xì)胞凋亡[6]。臨床研究[7]表明高尿酸血癥是胰島素抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，基礎(chǔ)研究證明高尿酸能誘導(dǎo)肝臟、肌肉和脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗。研究[8]證實(shí)胰島素抵抗是影響心衰預(yù)后的一個(gè)標(biāo)志物。然而，高尿酸血癥是否可以通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗影響心功能目前仍不清楚。高尿酸可增加多種靶細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激[9-10]，課題組前期研究[5]表明高尿酸處理后肝細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，且與胰島素抵抗有關(guān)。高尿酸在胰島素抵抗及心臟功能障礙中是否起到關(guān)鍵作用尚未確定。該研究通過體外原代心肌細(xì)胞、H9c2心肌細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)以及高尿酸動(dòng)物模型，探討高尿酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、胰島素信號(hào)通路和胰島素抵抗的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑熒光標(biāo)記葡萄糖2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑-4-氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖(簡(jiǎn)稱：2-NBDG)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；氧化應(yīng)激熒光探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(簡(jiǎn)稱：DCFH-DA)、尿酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(簡(jiǎn)稱：NAC)購(gòu)自美國(guó)ENZO Life Sciences公司；磷酸化Akt(Ser473)和Akt抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；磷酸化IRS1(Ser307)和IRS1(Ser307)抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；兔GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。所有化學(xué)試劑具有分析純級(jí)。尿酸儲(chǔ)備溶液濃度為15 mg/ml，最終實(shí)驗(yàn)濃度為15 mg/dl；NAC儲(chǔ)備溶液濃度為500 mmol/L，最終實(shí)驗(yàn)濃度為5 mmol/L。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理細(xì)胞研究使用H9c2大鼠心臟來源的胚胎肌細(xì)胞，用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM或低糖DMEM作為培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在37 ℃含5%CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞實(shí)驗(yàn)分為兩部分：① 明確高尿酸可使心肌細(xì)胞內(nèi)ROS增加，心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組(Control)、高尿酸作用組(HUA)、抗氧化劑作用組(NAC)、抗氧化劑+高尿酸作用組(NAC+HUA)；② 明確高尿酸通過氧化應(yīng)激抑制心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗，心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組(Control)、高尿酸作用組(HUA)、抗氧化劑作用組(NAC)、抗氧化劑+高尿酸作用組組(NAC+HUA)、胰島素作用組(Insulin)、胰島素+高尿酸作用組(Insulin+HUA)、抗氧化劑+胰島素作用組(NAC+Insulin)、抗氧化劑+胰島素+高尿酸作用組(NAC+Insulin+HUA)。將細(xì)胞以2.0×105個(gè)/ml密度接種在6孔板；在含高尿酸處理組，將細(xì)胞與含有15 mg/dl尿酸在新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育24 h；含抗氧化劑NAC作用組，將細(xì)胞與含5 mmol/L NAC新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)處理30 min；然后收集細(xì)胞用于生物化學(xué)或分子測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 熒光顯微鏡分析心肌細(xì)胞對(duì)熒光葡萄糖攝取使用熒光顯微鏡(CX21倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司)對(duì)心肌細(xì)胞對(duì)熒光葡萄糖攝取進(jìn)行定性分析。2-NBDG是一種2-脫氧熒光葡萄糖的類似物，被細(xì)胞吸收以后，由于無法代謝而在細(xì)胞內(nèi)積累，因此可作為細(xì)胞葡萄糖代謝的示蹤劑，熒光強(qiáng)度反映了葡萄糖吸收的情況。本實(shí)驗(yàn)通過熒光葡萄糖類似物2-NBDG評(píng)估H9c2心肌細(xì)胞對(duì)的葡萄糖攝取。用含F(xiàn)BS的低糖DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，然后用含有胰島素(100 nmol/L)和2-NBDG(100 μmol/L)的KRB緩沖液替換培養(yǎng)基。在37 ℃下作用30 min，用激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為485 nm和535 nm的熒光測(cè)定H9c2心肌細(xì)胞對(duì)的葡萄糖攝取。

1.4 流式細(xì)胞儀分析心肌細(xì)胞對(duì)熒光葡萄糖攝取使用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)對(duì)心肌細(xì)胞對(duì)熒光葡萄糖攝取進(jìn)行定量分析。用含F(xiàn)BS的低糖DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，然后用含有胰島素(100 nmol/L)和2-NBDG(100 μmol/L)的KRB緩沖液替換培養(yǎng)基在37 ℃下30 min。處理后從培養(yǎng)基中洗去游離的2-NBDG，分別在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm和525 nm下通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖2-NBDG的攝取。數(shù)據(jù)分析使用流式細(xì)胞儀相關(guān)軟件。統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析及Tukey-Kramer多重比較分析。

1.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS測(cè)定將細(xì)胞在6孔板(2.0×105個(gè)/孔)中傳代培養(yǎng)并使其附著作用于高尿酸24 h，并如上所述在37 ℃用10 mmol/L DCFH-DA染色30 min。通過熒光顯微鏡對(duì)染色的細(xì)胞成像，并分別在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm和480 nm下通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS分析。

1.6 急性高尿酸模型的構(gòu)建8周齡C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過1周的環(huán)境適應(yīng)時(shí)間。取9周齡小鼠12只，隨機(jī)選擇6只作為對(duì)照組，另外6只作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠禁食過夜，對(duì)照組根據(jù)體質(zhì)量給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃和腹腔注射，實(shí)驗(yàn)組給予500 mg/kg次黃嘌呤灌胃以及300 mg/kg氧嗪酸鉀腹腔注射處理；用磷鎢酸法檢測(cè)不同時(shí)間(0、1、2、3、4、6 h)小鼠血清中尿酸水平，建立急性高尿酸模型。

2 結(jié)果

2.1 高尿酸抑制胰島素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取為了確定高尿酸是否在體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗，將H9c2心肌細(xì)胞用不同濃度(0、5、10、15、20 mg/dl)的尿酸預(yù)處理不同時(shí)間(0、0.5、1.0、8.0、16.0、24.0 h)，通過流式細(xì)胞儀對(duì)胰島素刺激的心肌細(xì)胞2-NBDG攝取進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素顯著增加H9c2心肌細(xì)胞中2-NBDG攝取，高尿酸(15 mg/dl)預(yù)處理24 h后明顯抑制心肌細(xì)胞胰島素誘導(dǎo)的2-NBDG攝取率[(23.13±1.92)%vs(72.85±4.88)%，P<0.05]。因此，高尿酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗并抑制胰島素刺激下心肌細(xì)胞葡萄糖的攝取。見圖1。

圖1 尿酸對(duì)H9c2心肌細(xì)胞2-NBDG攝取的影響

2.2 高尿酸誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激與Control組比較，高尿酸預(yù)處理24 h后H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯升高[Control:(4.15±0.89)%vsHUA:(50.03±4.53)%，P<0.05]。用抗氧化劑NAC預(yù)處理能夠部分逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞內(nèi)高尿酸產(chǎn)生的ROS[HUA+NAC:(17.55±1.85)%vsHUA:(50.03 ± 4.53)%，P<0.05]，表明高尿酸可直接引起H9c2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激。見圖2。

圖2 高尿酸對(duì)H9c2心肌細(xì)胞ROS的影響

2.3 高尿酸通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)H9c2和原代心肌細(xì)胞胰島素抵抗抗氧化劑NAC預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了高尿酸抑制的胰島素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞2-NBDG葡萄糖攝取[NAC+Insulin+HUA:(62.20±4.51)%vsInsulin+HUA:(31.98±3.74)%，P<0.05]，表明氧化應(yīng)激在高尿酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胰島素抵抗中起到關(guān)鍵作用。見圖3。

圖3 高尿酸對(duì)H9c2心肌細(xì)胞2-NBDG葡萄糖攝取的影響

2.4 高尿酸激活心肌細(xì)胞胰島素負(fù)調(diào)節(jié)蛋白IRS1(Ser307)磷酸化，抑制胰島素信號(hào)蛋白Akt磷酸化與激活胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的其他磷酸化位點(diǎn)的IRS1(Ser307)比較，磷酸化IRS1(Ser307)抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。在本研究中，高尿酸增加H9c2心肌細(xì)胞中的磷酸化IRS1(Ser307)水平(HUAvsControl：P<0.01，F(xiàn)=27.71)。此外，高尿酸部分逆轉(zhuǎn)了胰島素對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中磷酸化IRS1(Ser307)的抑制(HUA+InsulinvsInsulin：P<0.01，Q=11.70)。為了確定高尿酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否激活H9c2心肌細(xì)胞中的磷酸化IRS1(Ser307)，課題組用抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞觀察高尿酸誘導(dǎo)磷酸化IRS1(Ser307)水平的表達(dá)。NAC抵消了高尿酸誘導(dǎo)的磷酸化IRS1(Ser307)過表達(dá)(NAC+HUAvsHUA：P<0.05，Q=4.79)，表明氧化應(yīng)激在高尿酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗中起到關(guān)鍵作用。見圖4A。

圖4 高尿酸對(duì)H9c2心肌細(xì)胞磷酸化IRS1(Ser307)及磷酸化Akt的影響

Akt是胰島素依賴性PI3K通路在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中激活的Ser/Thr蛋白激酶。課題組檢測(cè)了高尿酸在H9c2細(xì)胞中是否抑制了胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化，結(jié)果顯示高尿酸顯著抑制胰島素誘導(dǎo)的磷酸化Akt水平(HUA+InsulinvsInsulin：P<0.01，Q=9.45)。見圖4B。

另外，課題組進(jìn)一步討論了抗氧化劑NAC對(duì)高尿酸抑制心肌細(xì)胞Akt磷酸化的影響。NAC不影響胰島素誘導(dǎo)的磷酸化Akt水平，但明顯改善高尿酸對(duì)胰島素誘導(dǎo)的磷酸化Akt的抑制(NAC+HUA+InsulinvsHUA+Insulin：P<0.05，Q=5.08)?？寡趸瘎┠孓D(zhuǎn)高尿酸對(duì)磷酸化Akt水平的抑制，證明氧化應(yīng)激在高尿酸對(duì)胰島素下游信號(hào)通路具有重要影響。見圖4B。

2.5 高尿酸血癥增加磷酸化IRS1(Ser307)水平并抑制小鼠心肌組織中胰島素誘導(dǎo)的Akt磷酸化高尿酸血癥小鼠模型中血清尿酸水平高于誘導(dǎo)前，這與原發(fā)性高尿酸血癥患者一致。在葡萄糖或胰島素注射后15和30 min，小鼠模型顯示葡萄糖耐量受損(P<0.05，圖5A)和胰島素耐受(P<0.05，圖5B)。進(jìn)而檢測(cè)急性高尿酸血癥對(duì)小鼠模型的心臟組織中的胰島素信號(hào)通路蛋白的影響。胰島素腹膜內(nèi)注射高尿酸血癥小鼠10 min，然后處死獲得心肌組織。高尿酸血癥增加小鼠心肌組織中IRS1(Ser307)的磷酸化水平(P<0.01，圖5C)；在急性高尿酸血癥小鼠的心肌組織中磷酸化Akt水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05，圖5D)，表明高尿酸血癥在體內(nèi)明顯影響胰島素下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)。高尿酸通過氧化應(yīng)激激活磷酸化IRS1(Ser307)水平，進(jìn)而抑制Akt(Ser 437)磷酸化，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞胰島素抵抗(圖5E)。

圖5 高尿酸血癥誘導(dǎo)小鼠心肌組織胰島素抵抗及示意圖

3 討論

本研究討論了高尿酸誘導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞胰島素抵抗及葡萄糖攝取的影響。高尿酸血癥與許多心血管疾病密切相關(guān)[1]，如心力衰竭、高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病，但缺乏解釋這種關(guān)聯(lián)的病理機(jī)制。體外高尿酸增加胰腺β細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激[7-8]，而研究表明氧化應(yīng)激是許多細(xì)胞類型(包括心肌細(xì)胞)中胰島素抵抗的主要介質(zhì)[10-11]。此外，胰島素抵抗是心力衰竭患者死亡的危險(xiǎn)因素，心肌氧化應(yīng)激通常伴有胰島素抵抗[12-13]。高尿酸可以加重胰島素抵抗，這在課題組前期的研究[5]中得到證實(shí)：證明高尿酸可以通過氧化應(yīng)激直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗。本研究結(jié)果為高尿酸作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素提供了新的證據(jù)，為高尿酸如何抑制心肌細(xì)胞葡萄糖代謝及高尿酸相關(guān)心血管疾病提供新的解釋。

研究[14]表明細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖代謝來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)和存活，心臟生長(zhǎng)和代謝是通過復(fù)雜的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)整合來協(xié)調(diào)。高尿酸明顯抑制了心肌細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取，導(dǎo)致胰島素抵抗，但高尿酸是通過何種機(jī)制誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗并抑制了心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，仍不得而知。

已有研究[15]表明骨骼肌中H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與胰島素抵抗有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)高尿酸直接增加了心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，提示高尿酸誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。此外，課題組檢測(cè)了抗氧化劑NAC在高尿酸抑制胰島素刺激下心肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，抗氧化劑NAC明顯逆轉(zhuǎn)了心肌細(xì)胞中高尿酸抑制胰島素刺激的2-NBDG攝取，結(jié)果表明高尿酸通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗從而抑制了心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，這與新近一項(xiàng)研究[16]相符，該研究顯示氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗進(jìn)而增加H9c2心肌細(xì)胞凋亡。

本研究討論了高尿酸誘導(dǎo)心肌細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制，高尿酸通過降低葡萄糖攝取來改變心肌細(xì)胞能量代謝，高尿酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胰島素抵抗可能導(dǎo)致心臟功能障礙，為高尿酸血癥相關(guān)代謝性心血管疾病的提供了新的證據(jù)。然而，本研究?jī)H從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高尿酸通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素抵抗從而抑制了心肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，但人高尿酸血癥是一種慢性過程，需要進(jìn)一步在動(dòng)物模型上研究高尿酸血癥和胰島素抵抗的關(guān)系。