王友強(qiáng)，蘭由玉，張 為，姚 娟，鄒興靜，劉 偉

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（瀘州 646000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性炎癥性免疫性疾病，其患病率約為1%，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的滑膜增生和關(guān)節(jié)破壞，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，功能喪失和生活質(zhì)量下降[1]。成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibro?blast-like synovial cells，F(xiàn)LS）是關(guān)節(jié)滑膜組織中的主要細(xì)胞，F(xiàn)LS的過度增生和滑膜血管翳形成是RA滑膜炎發(fā)展的關(guān)鍵因素，并且還表現(xiàn)出細(xì)胞增殖與凋亡失調(diào)[2-3]，F(xiàn)LS釋放多種細(xì)胞因子加速了RA關(guān)節(jié)的破壞[4-5]。細(xì)胞周期進(jìn)程的失調(diào)可導(dǎo)致FLS的過度生長，RA中細(xì)胞周期相關(guān)基因的異常表達(dá)可影響FLS的細(xì)胞周期進(jìn)程[2，6]。

CC 趨化因子受體5（CC Chemokine Receptor 5，CCR5）是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，與相應(yīng)的促炎性趨化因子結(jié)合后在RA 等炎癥性免疫性疾病中有著重要的作用[7-8]。CCR5 與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)，其高效拮抗劑可減少膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的關(guān)節(jié)炎癥[9]。并且有研究發(fā)現(xiàn)CCR5 在RA 中明顯升高，并與RA 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10-11]。小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)[12]，主要是一種利用siRNA靶向沉默目標(biāo)基因表達(dá)的技術(shù)。目前RA的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，CCR5 在其中的作用機(jī)制報道甚少，因此本研究擬通過RNA 干擾技術(shù)抑制RA 大鼠滑膜細(xì)胞CCR5 的表達(dá)，以探討CCR5 基因沉默對RA 大鼠滑膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，以便于進(jìn)一步探尋RA的發(fā)病機(jī)制及可能的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級Wistar 雄性大鼠30 只，體重（171±8）g，購買于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)通過了西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 材料 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（美國Invitro?gen 公司），弗氏完全佐劑（CFA）（美國Sigma 公司），Trizol Reagent（日本Takara公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），MTT（美國Solarbio公司），PI染色液（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），CCR5 抗體、兔抗鼠Cyclin D1、兔抗鼠Cyclin E1、兔抗鼠Cyclin B1（英國Ab?cam公司），二抗（兔抗羊IgG）（英國Abcam公司），GAP?DH（美國Invitrogen 公司），PCR 試劑盒（日本Takara 公司），CCR5 siRNA（3 條）和NC siRNA（1 條）序列由GeneChem公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA 載體構(gòu)建 將事先設(shè)計(jì)好的大鼠CCR5 siRNA（3條）和NC siRNA（1條）序列（見表1）經(jīng)處理后構(gòu)建成pU6-siRNA-GFP 載體（均由GeneChem 公司完成），再通過Lipofectamine 2000將載體轉(zhuǎn)入大鼠滑膜細(xì)胞，操作按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染完成48 h 后檢測細(xì)胞CCR5 mRNA的水平以判斷各條siRNA的轉(zhuǎn)染效率，我們前期的研究[13]已經(jīng)明確選取了效率最佳的一條（CCR5 siRNA-2）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 CCR5 siRNA序列Table 1 CCR5 siRNA sequences

1.2.2 RA大鼠模型構(gòu)建 SPF級Wistar雄鼠30只適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為2 組：Control 組10 只、RA 組20只。用膠原蛋白誘導(dǎo)法[14]構(gòu)建RA 大鼠模型，具體方法為：將Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于濃度為0.1 mmol/L 的醋酸溶液中，然后再將相同劑量的弗氏完全佐劑（com?plete freund’s adjuvant，CFA）充分與上述混合液一起混勻，最后放置在冰浴中待其完全乳化；用注射器在Wi?star雄鼠尾根部多處注射，同樣的方法再于1周后重復(fù)操作一次；Control組的Wistar雄鼠可以在同樣的時間、同樣的部位僅注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg。采用關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)（arthritis index，AI）評分法評估RA 大鼠模型是否構(gòu)建成功，AI大于或等于4分提示造模成功，四肢評分標(biāo)準(zhǔn)見表2，每隔5 d觀察一次。

表2 AI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Arthritis Index score

1.2.3 滑膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 用6 g/L的Ⅱ型膠原酶處理滑膜組織，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化3 h；再將細(xì)胞團(tuán)用2.5 g/L的胰蛋白酶消化5 min；離心棄上清，將得到的細(xì)胞重新懸浮于含1.5 mL/L 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3～5 d使用臺盼藍(lán)初步判斷細(xì)胞的存活率，若存活率大于95%，可供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。第7 d，經(jīng)2.5 g/L的胰酶-EDTA消化傳代細(xì)胞，取3代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 滑膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前24 h，將待轉(zhuǎn)染的大鼠滑膜細(xì)胞以2×105個/mL 的密度鋪于6 孔板內(nèi)；每孔添加500 uL 不含抗生素的完全培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，待細(xì)胞匯合達(dá)50%即可用于轉(zhuǎn)染。本研究將細(xì)胞分為4 組：RA 組（RA 大鼠滑膜細(xì)胞）、RA+NC 組（加入脂質(zhì)體包裹的NC siRNA）、RA+mock組（加入脂質(zhì)體）、RA+siRNA組（加入脂質(zhì)體包裹的CCR5 siRNA）。轉(zhuǎn)染前更換細(xì)胞培養(yǎng)基（37 ℃預(yù)溫），用250 μL 不含血清培養(yǎng)基OPti-MEM 稀釋100 pmol mock、siRNA（終濃度50 nM）及5 μL liPofectamin 2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min后加入6孔板中輕搖，常溫放置20 min；再在6 孔板中添加含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2放置6～8 h 后，換完全培養(yǎng)基，持續(xù)放置48 h后獲取細(xì)胞。

1.2.5 CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1 mRNA及蛋白水平測定 各組滑膜細(xì)胞用Trizol 法提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以GAPDH 為內(nèi)參基因，將cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列，見表3。滑膜細(xì)胞以2×105個/mL的濃度平鋪于6 孔板培養(yǎng)72 h，加入蛋白裂解液提取蛋白，再利用10%SDS分離膠與濃縮膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，滴加稀釋的一抗兔抗鼠CCR5、兔抗鼠Cyclin D1、兔抗鼠Cy?clin E1、兔抗鼠Cyclin B1，4 ℃孵育過夜；加入二抗37 ℃振蕩孵育l h后用化學(xué)發(fā)光儀檢測。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

1.2.6 MTT檢測細(xì)胞增殖情況 選取對數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞以2×105個/mL 的密度100 μL 平鋪于96 孔板，每組各有3個相同的孔。在37 ℃、5%CO2條件下過夜，待細(xì)胞逐漸貼壁，24 h后換液，分別在相同條件下培育后的第0、24、48 和72 h 時添加5 mg/mL 的MTT 20 μL再培育4h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min。酶標(biāo)儀分別測定第0、24、48和72 h時各孔吸光值（A490）值，并作好記錄，以3孔的平均值為最終結(jié)果。

1.2.7 PI 單染檢測細(xì)胞周期 將快速生長期的滑膜細(xì)胞鋪于6 孔板，其密度為1.2×105個/mL，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。用不含EDTA 的胰酶消化、收集細(xì)胞，2 500 rpm/min 離心5 min。PBS 洗滌× 2次，離心收集細(xì)胞，加3mL 70%酒精處理，4 ℃靜置一夜。第二天，離心，去除上清液，添加PI 染色液，4 ℃避光30min。染色結(jié)束后，用細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀上樣，在大于575 nm下檢測PI，計(jì)算細(xì)胞周期百分比。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 21.0 分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，兩樣本均數(shù)比較t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kol?mogorov-Smirnov 法，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間比較使用One way AVONA 分析。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA大鼠模型鑒定

在給大鼠注射弗氏完全佐劑（CFA）8 h后，RA組大鼠在注射一側(cè)足趾部位出現(xiàn)紅腫等關(guān)節(jié)炎癥的表現(xiàn)，24 h后出現(xiàn)足踝部腫脹。10 d后RA模型大鼠表現(xiàn)出多關(guān)節(jié)炎，具體為前肢或?qū)?cè)肢體甚至耳、尾均有前面所述的炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)。皮毛暗沉，有部分褪毛現(xiàn)象，體重下降，食欲減退，活動量減少，甚至有脫皮、潰瘍和結(jié)節(jié)。10 d 時RA 組大鼠AI（1.31 ± 0.63）較5 d 時（0.98±0.54）明顯升高（P ＜0.05）；分別與10 d（1.45 ± 0.58）、15 d（5.06±1.29）時AI 比較，25 d 時AI（7.22±1.23）進(jìn)一步增高（P ＜0.05），且AI隨著時間的增加而升高，見圖1。而Control 組大鼠無關(guān)節(jié)炎癥等表現(xiàn)。由此可見RA大鼠模型構(gòu)建成功。

圖1 RA組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）Figureure 1 The Arthritis Index of RA group

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染大鼠滑膜細(xì)胞48 h 后，qRT-PCR 測定CCR5 mRNA表達(dá)水平，由圖2可知，與CCR5 siRNA-NC組相比，3 條siRNA 序列轉(zhuǎn)染后均可引起CCR5 mRNA 明顯下降（P ＜0.05），其中CCR5 siRNA-2 序列轉(zhuǎn)染效率較CCR5 siRNA-1 和CCR5 siRNA-3 更高。因此本研究選用CCR5 siRNA-2序列為最終實(shí)驗(yàn)所用序列，進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 CCR5 siRNA序列轉(zhuǎn)染效率Figureure 2 CCR5 siRNA transfection efficiency

2.3 沉默CCR5 對CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cy?clin B1 mRNA水平的影響

各組RA 大鼠滑膜細(xì)胞CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1 mRNA 表達(dá)水平如圖3A、3B 所示：與RA組相比，RA+siRNA 組CCR5 mRNA 表達(dá)水平（1.16 ±0.21）較（1.85±0.61）明顯下降（P ＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了CCR5 siRNA 轉(zhuǎn)染是有效的，見圖3A；圖3B 提示，RA+siRNA 組Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1 mRNA 水平（1.32±0.01）、（1.23±0.26）、（1.33±0.05）分別較RA組（1.52±0.06）、（1.68±0.08）、（1.94±0.07）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而RA+NC組、RA+mock組較RA組無明顯變化（P ＞0.05）。

圖3 CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1 mRNA水平比較Figureure 3 ThemRNAexpressionofCCR5、CyclinD1、CyclinE1、CyclinB1

2.4 沉默CCR5 對CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cy?clin B1蛋白水平的影響

各組RA 大鼠滑膜細(xì)胞CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1蛋白表達(dá)水平如圖4A、4B所示：與RA組相比，RA+siRNA 組CCR5 蛋白水平（0.19 ± 0.01）較（0.44±0.05）明顯下降（P ＜0.05），見圖4A；由圖4B可知，RA+siRNA 組Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1 蛋白水平（0.88±0.03）、（1.46±0.13）、（1.56±0.13）分別較RA組（1.38±0.03）、（1.98±0.12）、（2.13±0.08）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而RA+NC 組、RA+mock組較RA組無明顯變化（P ＞0.05）。

圖4 CCR5、Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin B1蛋白水平比較Figureure 4 TheproteinexpressionofCCR5、CyclinD1、CyclinE1、CyclinB1

2.5 CCR5基因沉默對RA大鼠滑膜細(xì)胞增殖的影響

本研究采用MTT 協(xié)助判斷沉默CCR5 對RA 大鼠滑膜細(xì)胞增殖情況的影響，見圖5。與RA 組相比，RA+siRNA 組滑膜細(xì)胞出現(xiàn)明顯生長抑制，且隨時間增長其抑制效果逐漸增大（P ＜0.05），而RA+mock組、RA+NC組無特別變化（P ＞0.05）。

圖5 各組RA大鼠滑膜細(xì)胞增殖情況比較Figureure 5 The synoviocytes proliferation of each group

2.6 沉默CCR5對RA細(xì)胞周期分布的影響

PI 單染測定細(xì)周期分布情況，見圖6。與RA 組對比，RA+siRNA 組RA 大鼠滑膜細(xì)胞G0/G1 期比例（70.27 ± 1.06）%較（59.26 ± 0.59）%上升，S 期比例（14.10±0.82）%較（23.94±1.71）%降低（P ＜0.05），而RA+mock、RA+NC組無明顯變化（P ＞0.05）。

圖6 各組RA大鼠滑膜細(xì)胞細(xì)胞周期分布情況比較Figureure 6 The cell cycle distribution of each group

3 討論

RA 發(fā)病機(jī)理受多種因素的影響，包括遺傳、表觀遺傳學(xué)和環(huán)境因素以及免疫紊亂和細(xì)胞因子等因素[15-16]?；罨腞A-FLS 表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞相似的增殖特征，其腫瘤樣增殖特性可導(dǎo)致滑膜增生發(fā)展，逐漸出現(xiàn)軟骨的侵蝕及關(guān)節(jié)破壞[3，17]。RA-FLS 具有激活細(xì)胞周期和抗細(xì)胞凋亡的特性，從而可導(dǎo)致細(xì)胞增殖[18]。同時，細(xì)胞周期又控制著細(xì)胞生長或凋亡的潛力[6，19]。

細(xì)胞周期分為DNA合成前期（G1期），DNA合成期（S期），DNA合成后期（G2期）和分裂期（M期），大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期[20]。細(xì)胞周期的正確進(jìn)展取決于細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cdks）的激活[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCR5 siRNA干預(yù)后RA大鼠滑膜細(xì)胞的生存能力受到抑制，G0/G1 期滑膜細(xì)胞比例增大，S 期細(xì)胞的比例減少，提示沉默CCR5 可明顯抑制滑膜細(xì)胞的生長，并影響細(xì)胞周期的分布。有還研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子將細(xì)胞周期阻滯在G1 到S 相轉(zhuǎn)變，即G1 停滯，即可抑制FLS 的增殖[22]。細(xì)胞周期從G1 到S 期的進(jìn)展還受Cyclin D 和Cy?clin E及其同系激酶CDK 2，CDK 4和CDK 6的調(diào)節(jié)[22]，且可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/ G1 期來抑制RA-FLS的增殖[23]。

此外，CCR5沉默可抑制CCR5的表達(dá)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，相應(yīng)地，CCR5、Cyclin D1、Cy?clin E1 和Cyclin B1 的表達(dá)均降低。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑是控制RA-FLS 分裂和增殖的強(qiáng)制因素，可先后作用于Cyclin D、pRB和Cyclin E，進(jìn)而加速RA-FLS的DNA合成和增殖[6]。其中cyclin D1 在RA 的滑膜細(xì)胞增殖和凋亡中起了重要作用[24]。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的異常表達(dá)與RA的疾病進(jìn)展有關(guān)[19]。Cyclin D1和Cyclin E1是細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子[25]，主要調(diào)控G1/S 期轉(zhuǎn)化，其中Cyclin D1的主要功能在于促進(jìn)細(xì)胞增殖，而Cyclin E是G1晚期的重要調(diào)控因子；Cyclin B1是細(xì)胞周期中G2/M階段的主要介質(zhì)[26]，主要與M期的完成有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，沉默CCR5可抑制滑膜細(xì)胞的生長，使G0/G1期滑膜細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，還可通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)來影響細(xì)胞周期的分布，進(jìn)而抑制滑膜細(xì)胞的增殖。本研究為CCR5基因沉默作為RA治療的潛在靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但還需進(jìn)一步大規(guī)模的研究闡明RA 滑膜細(xì)胞中CCR5的潛在機(jī)制。

（利益沖突：無）