譚 丹，劉 瑤，王忠朝，胡 蕓，胡妙齡，張夢雪，毛婭林，聶敏海

西南醫(yī)科大學(xué)1.口腔頜面修復(fù)重建與再生實(shí)驗(yàn)室（瀘州 646000）；2.附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜病科（瀘州 646000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OS?CC）是口腔最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)約占口腔腫瘤的90%。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一，因此對(duì)OSCC轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，進(jìn)而阻斷其轉(zhuǎn)移，對(duì)提高患者預(yù)后具有重要的意義[1]。

鈣中性蛋白酶（calpain，CAPN）是一類特異性依靠鈣激活的中性半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，被一定濃度的鈣離子激活后發(fā)生自溶表現(xiàn)出蛋白水解酶活性[2]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CAPN 至少有14 種亞型，根據(jù)其分布特點(diǎn)分為有組織特異性中性鈣蛋白酶和無組織特異性中性鈣蛋白酶兩大類，目前人們研究比較深入的是非組織特異性的同工酶CAPN-Ⅰ與CAPN-Ⅱ，目前CAPN 許多亞型的生理功能及調(diào)控蛋白水解的機(jī)制尚未完全明確[3-6]。CAPN在病理過程中的研究一直以來主要集中于炎癥，神經(jīng)退行性病變等，近年來在腫瘤中的作用逐漸被人們所重視，越來越多的研究表明CAPN 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且具有腫瘤特異性[7-9]。

CAPN與口腔鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系少有報(bào)道，本研究主要從細(xì)胞和分子水平探討CAPN1 對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞黏附、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，從而探索CAPN1與口腔鱗癌預(yù)后的關(guān)系，并為CAPN1作為口腔鱗癌的治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

于2017年6月至2018年6月在西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建與再生實(shí)驗(yàn)室完成實(shí)驗(yàn)。選取人類永生化口腔角化上皮細(xì)胞系HOK作為對(duì)照組（正常組），口腔鱗癌細(xì)胞系HSC3、CAL27 作為實(shí)驗(yàn)組（腫瘤組），均由實(shí)驗(yàn)室保種。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：①Western blot 相關(guān)試劑：SDS-PAGE試劑、勻漿緩沖液；固相載體：PVDF尼龍膜或NC膜（硝酸纖維素薄膜）、轉(zhuǎn)膜緩沖液；膜染色液：考馬斯亮藍(lán)0.2 g；甲醇80 mL；乙酸2 mL；ddH2O 118 mL。封閉液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 mL 的0.01 mol/L PBS 中。顯色液：化學(xué)發(fā)光劑（ECL）或DAB 6.0 mg，0.01 mol/L PBS 10.0 mL，硫酸鎳胺0.1 mL；H2O21.0 mL。②RNA 干擾相關(guān)試劑：siRNA 干擾位點(diǎn)序列轉(zhuǎn)染使用Invitrogene 公司生產(chǎn)的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000。主要儀器：電泳儀、搖床、Transwell小室等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞放入10 % 的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，添加青霉素，放入37 ℃孵箱中。當(dāng)細(xì)胞長至瓶底70%左右時(shí)，用胰消化酶消化細(xì)胞，離心，棄上清液，收集細(xì)胞，清洗，重懸，傳代細(xì)胞。細(xì)胞長至80%左右，分組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，提取RNA或蛋白質(zhì)。

1.3.2 RNA 干擾阻滯CAPN1 以O(shè)SCC 細(xì)胞株HSC3、CAL27為研究對(duì)象，將這兩組細(xì)胞隨機(jī)分為siRNA1-1組、siRNA1-2 組、siRNA-neg 組。siRNA1-1 組：在HSC3、CAL27中分別轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的針對(duì)CAPN1-1設(shè)計(jì)的小分子干擾RNA，沉默CAPN1-1 基因；siRNA1-2組：在HSC3、CAL27 中分別轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的針對(duì)CAPN1-2 設(shè)計(jì)的小分子干擾RNA，沉默CAPN1-2 基因：；siRNA-neg組：采用一對(duì)經(jīng)驗(yàn)證對(duì)任何人、小鼠基因序列均無特異性干擾作用的siRNA（si NC）為陰性對(duì)照。應(yīng)用PCR 法和Western blot 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)CAPN亞型CAPN1的mRNA和蛋白水平的變化。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，加蛋白裂解液，離心，取上層液體，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉密封1 h，試劑盒測濃度，加一抗，培育24 h后緩沖液洗滌，加二抗，避光培育1 h，顯影。

1.3.4 QT-PCR 在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，加異丙醇，離心，加75 %乙醇離心，干燥，-80 ℃保存。重復(fù)40 次反轉(zhuǎn)錄體系（94 ℃15 min，94 ℃15 s，60 ℃34 s，72 ℃10 min），計(jì)算。

1.3.5 細(xì)胞體外侵襲能力及遷移能力測定 細(xì)胞侵襲重建基底膜實(shí)驗(yàn)在Transwell 小室中進(jìn)行。Transwell 小室分為上下兩層，中間以聚碳酸濾膜（8 μm 孔徑）隔開，濾膜上鋪以ECMgel，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的HSC3 和CAL27 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。將Transwell 小室的上室浸泡于下室培養(yǎng)液中，上室加入200 μL 細(xì)胞懸液（2×105個(gè)），細(xì)胞在上層常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室，吸去Transwell上下室中的培養(yǎng)液，用無菌棉簽快速擦去Transwell上室的ECMgel和未侵襲的細(xì)胞，再用DMEM 培養(yǎng)基浸濕的棉簽重復(fù)擦Transwell 上室2～3 次，將Transwell 下表面浸泡于70%甲醇中固定30 min，再用蘇木素-伊紅浸染位于Transwell 下表面的細(xì)胞，梯度酒精脫水，二甲苯透明，在200 × 光鏡下計(jì)數(shù)位于Transwell 下表面的細(xì)胞，計(jì)數(shù)中間和四周5 個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取其中平均值代表侵襲力的值。根據(jù)穿膜的數(shù)值做侵襲條形圖。細(xì)胞體外遷移能力測定該實(shí)驗(yàn)與侵襲的差異在于在濾膜上未鋪以ECMgel，其余相同。計(jì)數(shù)中間和四周5 個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值代表遷移能力的值。根據(jù)穿膜的數(shù)值制作條形圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較采用Dunnett-t法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAPN1在正常細(xì)胞及口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，CAPN1 在OSCC 腫瘤組（HSC3、CAL27組）中的表達(dá)高于正常組（HOK組），P ＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 RNA干擾抑制口腔鱗癌細(xì)胞CAPN1的表達(dá)

QT-PCR 檢測顯示：siRNA1-1、siRNA1-2、及siR?NA-neg組中三組皆見actin內(nèi)參明顯均一的表達(dá)；三組皆見CAPN1 mRNA 的表達(dá)，與siRNA-neg 組相比，siR?NA1-1 組及siRNA1-2 組組中CAPN1 mRNA 的表達(dá)均明顯受到抑制（P ＜0.05），分別抑制了90%、93%。該結(jié)果提示siRNA CAPN1-1、siRNA CAPN1-2 轉(zhuǎn)染能特異地抑制CAPN1 mRNA表達(dá)，見圖1。

圖1 QT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CAPN1蛋白表達(dá)水平的改變Figure 1 changes of CAPN1 in transfected cells detected by RT-PCR

2.3 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CAPN1 蛋白表達(dá)水平的改變

Western blot檢測結(jié)果顯示：CAPN1干擾后體外培養(yǎng)的HSC3 和CAL27 細(xì)胞中CAPN1 蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染48 h 后，在HSC3 和CAL27 細(xì)胞中，與siRNA-neg 組相比 siRNA CAPN1-1 組、siRNA CAPN1-2 組的CAPN1 蛋白的表達(dá)受到明顯抑制（P ＜0.05），這與mRNA水平的變化基本一致，見圖2。

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CAPN1蛋白表達(dá)水平Figure 2 Western blot was used to detect the expression level of CAPN1 in transfected cells

2.4 小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力的影響

3 組細(xì)胞的侵襲能力，通過計(jì)數(shù)在趨化誘導(dǎo)48 h后，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)目來檢測的。顯微鏡下顯示siR?NA1-2 組穿膜數(shù)目最少，siRNA-neg 組數(shù)目最多。siR?NA1-1 組、siRNA1-2 組較siRNA-neg 組數(shù)目均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），見圖3。

圖3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)測試腫瘤細(xì)胞侵襲能力Figure 3 Transwell chamber experiment tested the ability of tumor cells to invade

根據(jù)上圖穿膜細(xì)胞數(shù)目做條形圖。條形圖示：siR?NA1-1 組、siRNA1-2 組相比于siRNA-neg 組數(shù)目均有減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲數(shù)條形圖Figure 4 Percentage of cell migration after transfection

2.5 小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移能力的影響

同理，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，三組細(xì)胞穿過濾膜的數(shù)目變化趨勢作圖，如下圖5?？梢钥吹?，48 h后三組細(xì)胞數(shù)目不同，并且siRNA1-2 組數(shù)目最少，siRNA-neg 組數(shù)目最多。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，siRNA1-1組與siRNA1-2組相比于siRNA-neg 組數(shù)目均有減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。根據(jù)上圖做遷移條形圖，如下圖6。

圖5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)測試腫瘤細(xì)胞遷移能力Figure 5 Transwell chamber experiment tested the migration ability of tumor cells

圖6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移數(shù)條形圖Figure 6 Percentage of cell migration after transfection

條形圖示：siRNA1-1 組、siRNA1-2 組相比于siR?NA-neg組數(shù)目均有減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 討論

中性鈣蛋白酶系統(tǒng)在人和動(dòng)物的體內(nèi)廣泛存在，是一個(gè)高度復(fù)雜，高度調(diào)控的體系。中性鈣蛋白酶系統(tǒng)不僅包括CAPN 和鈣中性蛋白酶抑制蛋白（cal?pastatin），而且還包括鈣中性蛋白酶激活蛋白（CAPN activator）。三者之間構(gòu)成一個(gè)高度可調(diào)的依賴于鈣離子的蛋白水解酶系統(tǒng)。其中中性鈣蛋白酶（CAPN）是其系統(tǒng)中最核心的成分[10-12]。CAPN 在病理過程中的研究一直以來主要集中于炎癥，神經(jīng)退行性病變等，近年來在腫瘤中的作用逐漸被人們所重視，越來越多的研究表明CAPN 參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)研究也表明CAPN在多種腫瘤中起到的作用不盡相同[13-14]，最新研究顯示，在許多腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在CAPN的異常表達(dá)[2-3，10]，但目前國內(nèi)外關(guān)于CAPN家族與口腔鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性研究較少，本研究首次聚焦于CAPN 家族與口腔鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性。

CAPN系統(tǒng)在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮了重要的作用，大量研究表明其在細(xì)胞保護(hù)、凋亡、自噬通路中的作用較為明確，而在細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞遷移、侵襲方面的研究有限[1，4，13，21]，亟待系統(tǒng)建立CAPN 在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及細(xì)胞骨架重建方面的作用，本研究也首次嘗試探索CAPN1 在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)系，為口腔癌患者提供靶向治療的理論依據(jù)。

本研究在細(xì)胞及蛋白水平初探索了CAPN與口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移、侵襲的相關(guān)性，研究結(jié)果表明CAPN1 在鱗狀細(xì)胞中高表達(dá)，并且可升高口腔鱗癌細(xì)胞遷移、侵襲能力，可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，這些結(jié)果可能為口腔鱗狀細(xì)胞癌靶向治療提供了新的視角。

CAPN通過什么通路，具體如何影響腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移目前仍然存在多種說法，這些說法目前其實(shí)主要傾向于CAPN水解多種調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及肌球蛋白力學(xué)相關(guān)的底物發(fā)揮作用[15-21]，這些研究的背景也為我們下一步探索提供系新的方向。

4 結(jié)論

本研究主要通過生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法探討CAPN1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，從而初步探討CAPN1與口腔鱗癌的關(guān)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于正常細(xì)胞，口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在CAPN1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)通過RNA 干擾技術(shù)將CAPN1 沉默后對(duì)OS?CC 細(xì)胞學(xué)行為的作用進(jìn)行了初步探索，研究表明CAPN1 基因沉默引起OSCC 細(xì)胞侵襲和黏附能力下降，此結(jié)果提示CAPN1可能與腫瘤轉(zhuǎn)移或不良預(yù)后密切相關(guān)。

（利益沖突：無）