倪賢偉 趙應(yīng)征 余方芳 王小花 田新橋

阿霉素(doxorubicin，DOX)作為臨床上治療乳腺癌、淋巴瘤等疾病的最主要化療藥物之一，但存在明顯的心肌毒性，可在患者的治療過程中、甚至治愈后造成嚴(yán)重的心臟損傷并導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病，最終形成慢性心力衰竭[1～5]。有研究證實(shí)，改構(gòu)型酸性成纖維生長因子(modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF)具有抗氧化應(yīng)激、減少心肌細(xì)胞凋亡和改善心肌功能的作用，但作為一種生物大分子蛋白藥物，其缺點(diǎn)是穩(wěn)定性較差并易降解，臨床應(yīng)用受到很大限制[6,7]。本研究制備包載MaFGF的納米脂質(zhì)體(nanoliposomes，NP)并結(jié)合超聲靶向微泡爆破(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)技術(shù)對(duì)阿霉素心肌病(doxorubicin cardiomyopathy，DOX-CM)大鼠進(jìn)行干預(yù)，并探討對(duì)大鼠心功能影響及其機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只，鼠齡6～7周，體質(zhì)量180～220g,由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本研究得到溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)許可。

2.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：Auson Sequoia 512超聲診斷系統(tǒng)購自德國西門子公司，配備15L8W-S線陣探頭，探頭頻率為8.0～14.0MHz。改構(gòu)型酸性成纖維細(xì)胞生長因子(MaFGF)凍干粉由溫州醫(yī)科大學(xué)生物與天然藥物開發(fā)中心有限公司提供；SonoVue超聲微泡購自Bracco公司；Roche TUNEL試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B (pAKT)、B細(xì)胞淋巴瘤2(BCL-2)、B細(xì)胞淋巴瘤因子相關(guān)X蛋白(BAX)、甘油醛3-磷酸脫氫酶抗體(GAPDH)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.MaFGF-NP的制備及性能評(píng)價(jià)：采用水包水型乳化法結(jié)合冷凍干燥技術(shù)制備MaFGF-NP[7]。通過透射電子顯微鏡評(píng)估了MaFGF-NP的形態(tài)，動(dòng)態(tài)光散射法評(píng)估MaFGF-NP的粒徑。MaFGF-NP包封率測定：精密量取MaFGF納米脂質(zhì)體混懸液1.0ml于EP管離心后取上清液用ELISA試劑盒測定其中MaFGF蛋白濃度。包封率(%)=(總的蛋白量-上清液的蛋白量)/總的蛋白量×100%。

4.大鼠模型構(gòu)建及分組：50只SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組(n=10)，即正常對(duì)照組、DOX-CM模型組、MaFGF溶液組、MaFGF-NP組和MaFGF-NP+UTMD組。正常對(duì)照組外的其余4組大鼠均按體重3mg/kg通過腹腔注射鹽酸阿霉素溶液，每周1次，連續(xù)6周，使DOX的注射累積劑量達(dá)到18mg/kg，而正常對(duì)照組通過腹腔注射等容積的0.9%NaCl注射液。

5.實(shí)驗(yàn)干預(yù)方案：各組大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，正常對(duì)照組及DOX-CM模型組經(jīng)尾靜脈注射1ml 0.9%NaCl注射液；MaFGF溶液組經(jīng)尾靜脈按3μg/kg劑量注射1ml MaFGF溶液；MaFGF-NP組經(jīng)尾靜脈按3μg/kg劑量注射1ml MaFGF-NP溶液；MaFGF-NP+UTMD組在尾靜脈注射1ml MaFGF-NP(3μg/kg)溶液與SonoVue微泡的混懸液同時(shí)用超聲靶向爆破。

6.超聲靶向微泡爆破方式：大鼠麻醉后，脫毛膏除去心前區(qū)毛發(fā)，將15L8-w線陣探頭置于大鼠心前區(qū)，應(yīng)用超聲診斷系統(tǒng)并切換成超聲造影模式，在左心室短軸乳頭肌水平切面，將聚焦深度設(shè)為3.5～4.0cm，經(jīng)尾靜脈注射MaFGF-NP與SonoVue微泡混懸液，當(dāng)心肌內(nèi)出現(xiàn)大量微泡充盈同時(shí)即用超聲診斷系統(tǒng)自帶的MBD功能反復(fù)多次爆破(機(jī)械指數(shù)MI為1.9)，探頭在心前區(qū)移動(dòng)，覆蓋整個(gè)心臟區(qū)域，并在微泡完全消失后結(jié)束。上述操作均于大鼠腹腔注射鹽酸阿霉素后第4、6天，共進(jìn)行6周。

7.大鼠心功能評(píng)估：經(jīng)過6周干預(yù)后，通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脫毛膏心前區(qū)脫毛，在自制固定板上將大鼠以左側(cè)臥位的體位固定，并連接心電圖儀，大鼠心室收縮期標(biāo)志為心電圖的QRS波群而心室舒張期標(biāo)志為T波，在左心室短軸乳頭肌水平切面測量大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension-diastole，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension-systole，LVIDs)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)值，每只大鼠均測量3次并取平均值。

8.TUNEL熒光染色：取各組大鼠心肌組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化后進(jìn)行TUNEL熒光染色，心肌凋亡細(xì)胞測量：每張切片在400倍視野下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)該視野下所有細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞數(shù)。每組取12張切片，每張切片隨機(jī)取30～40個(gè)400倍視野，取其均值。

9.蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)：取各組大鼠心肌組織按WB標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行操作。

結(jié) 果

1.MaFGF-NP的表征：MaFGF-NP的電鏡圖像(圖1A)表明MaFGF-NP呈球形，平均直徑為73.5 nm。用DLS測定了MaFGF-NP的粒徑分布，平均粒徑為91.3nm(圖1B)。MaFGF脂質(zhì)體的包封率為75.52%±4.27%。

圖1 MaFGF-NP的表征分析A.MaFGF-NP的電鏡圖；B.MaFGF-NP粒徑分布圖

2.各組大鼠心功能結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，DOX-CM模型組LVIDs、LVIDd明顯升高(P均<0.05)而LVEF及LVFS明顯降低(P均<0.05)；干預(yù)6周后，MaFGF溶液組、MaFGF-NP組及MaFGF-NP+UTMD組的LVEF、LVFS較DOX-CM模型組明顯增高(P均<0.05)，而LVIDs、LVIDd較DOX-CM模型組明顯降低(P均<0.05)；而MaFGF治療3組間，MaFGF-NP+UTMD組LVEF、LVFS較MaFGF溶液組、MaFGF-NP組均明顯升高(P<0.05),詳見表1。

表1 5組大鼠心功能結(jié)果

3.大鼠心肌TUNEL熒光染色結(jié)果：大鼠心肌正常細(xì)胞細(xì)胞核熒光染成藍(lán)色，而TUNEL陽性(凋亡細(xì)胞)細(xì)胞核DNA片段熒光染成綠色(圖2A)。與正常對(duì)照組比較，DOX-CM模型組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞顯著增多(P<0.05)。MaFGF溶液組、MaFGF-NP組和MaFGF-NP+UTMD組TUNEL陽性細(xì)胞較DOX-CM模型組明顯減少(P均<0.05)，其中MaFGF-NP+UTMD組的TUNEL陽性細(xì)胞減少更加顯著(P<0.05,圖2B)。

圖2 大鼠心肌TUNEL熒光染色(×400)A.正常對(duì)照組；B.DOX-CM模型組；C.MaFGF溶液組；D.MaFGF-NP組；E.MaFGF-NP+UTMD組；F.5組大鼠心肌TUNEL凋亡陽性細(xì)胞定量分析。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與DOX-CM模型組比較，△P<0.05；與MaFGF-NP+UTMD組比較，▲P<0.05

4.大鼠心臟凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)：DOX-CM模型組大鼠心臟的BAX含量較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而BCL-2的含量則明顯降低(P<0.05))，同時(shí)pAKT/AKT比值明顯降低(P<0.05)。然而經(jīng)過MaFGF-NP聯(lián)合UTMD干預(yù)之后，大鼠的BAX的含量明顯下降(P<0.05)，BCL-2的含量明顯升高(P<0.05)，同時(shí)pAKT/AKT比值明顯升高(P<0.05)，且與MaFGF溶液組、MaFGF-NP組相比，MaFGF-NP+UTMD組的BAX的含量最低，BCL-2的含量最高，pAKT/AKT的比例最高(圖3)。

圖3 5組大鼠PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)A.AKT、pAKT、BCL-2及BAX蛋白WB法條帶圖；B.pAKT/AKT比例柱形圖；C.BCL-2蛋白相對(duì)量表達(dá)柱形圖；D.BAX蛋白相對(duì)量表達(dá)柱形圖。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與DOX-CM模型組比較，△P<0.05；與MaFGF-NP+UTMD組比較，▲P<0.05

討 論

阿霉素作為一種抗腫瘤藥物具有很強(qiáng)的心肌毒性，其累積毒性最終可導(dǎo)致慢性心力衰竭[4,5]。本研究通過腹腔方式注入鹽酸阿霉素至大鼠體內(nèi)構(gòu)建DOX-CM模型，6周后應(yīng)用超聲心動(dòng)圖測量大鼠左心室功能發(fā)現(xiàn)LVIDs、LVIDd較正常對(duì)照組明顯升高而LVEF、LVFS明顯降低，表明DOX的心肌毒性不僅導(dǎo)致大鼠心腔明顯擴(kuò)張，而且降低左心室收縮功能，因此有效防治DOX對(duì)心肌損傷具有重要臨床意義。

MaFGF是敲除aFGF促分裂活性功能，但保留非促分裂活性功能的改構(gòu)體，發(fā)揮著與aFGF等效的心肌保護(hù)作用(如抵抗氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡等功能)，并避免了aFGF促有絲分裂能力存在不良反應(yīng)的可能(如致癌等)[6,7]。但MaFGF作為一種生物大分子藥物，其穩(wěn)定性較差并易降解，在體內(nèi)應(yīng)用缺乏高效、安全、可控遞送方法，因此導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制。

納米脂質(zhì)體的粒徑多位于10～1000nm，由于其粒徑小，可以穿透完整的毛細(xì)血管，穿透內(nèi)皮間隙，可被大多數(shù)細(xì)胞攝取，而且還具備高載藥量，藥物緩慢釋放，高穩(wěn)定性，減少藥物用量等優(yōu)點(diǎn)[8～10]。本研究采用水包水型乳化法結(jié)合冷凍干燥技術(shù)制備包載MaFGF的納米脂質(zhì)體呈球形，粒徑分布均勻，平均粒徑為91.3nm，并用非共價(jià)物理結(jié)合的方式將超聲微泡作為MaFGF-NP的載體，在心肌組織靶向應(yīng)用超聲能量爆破攜載MaFGF-NP的微泡，將MaFGF-NP在心肌組織釋放并發(fā)揮其效能。應(yīng)用超聲心動(dòng)圖檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6周干預(yù)后，MaFGF-NP+UTMD組大鼠的LVEF、LVFS較DOX-CM模型組明顯升高，而LVIDs、LVIDd明顯減小，說明MaFGF-NP結(jié)合UTMD可有效防治DOX引起的心臟損害，并可以保護(hù)大鼠左心室功能。

DOX-CM作為阿霉素?fù)p傷心肌的最嚴(yán)重并發(fā)癥，其確切機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為是由多種因素(氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡、心肌電解質(zhì)紊亂等)共同導(dǎo)致[2,11]。已有研究證實(shí)在DOX-CM發(fā)病進(jìn)程中心肌細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵性的作用[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，TUNEL熒光染色結(jié)果顯示DOX-CM模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增多，而MaFGF-NP+UTMD組的心肌細(xì)胞凋亡顯著減少。另有研究表明激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以有效防止DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[14～16]。而磷酸化AKT(pAKT)可以調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)的活性，增加具有抗凋亡作用的BCL-2的表達(dá)并降低參與凋亡誘導(dǎo)的BAX的表達(dá)[17, 18]。因此MaFGF保護(hù)心肌細(xì)胞抗凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)pAKT的表達(dá)并激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。WB結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，DOX-CM模型組的心肌中的pAKT/AKT比值明顯降低，BAX水平升高而BCL-2水平降低，MaFGF-NP+UTMD治療組的pAKT/AKT比值和BCL-2表達(dá)水平較DOX-CM模型組明顯升高，而BAX表達(dá)水平降低。因此MaFGF-NP與UTMD聯(lián)合對(duì)DOX-CM的保護(hù)作用可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路減弱了心肌細(xì)胞的凋亡相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明超聲靶向心肌組織爆破攜載MaFGF-NP的超聲微泡可有效釋放MaFGF并發(fā)揮其減弱阿霉素心肌損傷的作用，保護(hù)大鼠的左心室收縮功能，其機(jī)制可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，并為治療DOX-CM提供一種新思路。