董 威 劉犇龍 師 巖 陳慶友 徐文雙 賈 迪 徐 晶

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常見眼部并發(fā)癥，在持續(xù)高血糖和部分毛細血管閉塞環(huán)境中易受氧化應(yīng)激損傷，其中視網(wǎng)膜色素上皮細胞作為視網(wǎng)膜外屏障耗氧多，產(chǎn)生大量氧自由基及活性氧，會直接損傷功能細胞，與DR的發(fā)病密切相關(guān)[1]。因此抗氧化治療成為防治DR的一個有效途徑。已經(jīng)證明梔子提取物京尼平，能防治多種發(fā)病機制與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的疾病，例如抑制高血糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，缺血再灌注引起的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷，能有效保護肝細胞氧化應(yīng)激損傷，減輕脊髓小腦神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷等作用[2～5]。但京尼平在糖尿病視網(wǎng)膜病變中能否發(fā)揮作用的報道較少，根據(jù)文獻建立高糖缺氧環(huán)境的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)氧化損傷模型，觀察京尼平對于ARPE-19細胞氧化損傷的作用，并探討相關(guān)機制[6]。

材料與方法

1.材料：人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19細胞株，上海生命科學(xué)院細胞資源中心)，Genipin和Nrf2抑制劑ML385(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，ROS檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒和AO/EB雙染試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Nrf2、HO-1和β-actin抗體(美國Cell signaling technology公司)，山羊抗兔抗體(武漢博士德生物公司)。

2.ARPE-19細胞培養(yǎng)和分組：10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液，加入1% 青-鏈霉素混合液，在37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代一次，細胞生長近70% 融合時，換用無血清培養(yǎng)液12h后分組培養(yǎng)：對照組(加入5.5mmol/L濃度葡萄糖)、模型組(加入25mmol/L高濃度葡萄糖和150μmol/L CoCl2模擬體外高糖和缺氧環(huán)境)、京尼平組(10μmol/L京尼平預(yù)處理4h后加入25mmol/L高濃度葡萄糖和150μmol/L CoCl2)、Nrf2抑制劑組(10μmol/L京尼平和Nrf2 抑制劑2μmol/L ML385 預(yù)處理4h后加入25mmol/L高濃度葡萄糖和150μmol/L CoCl2)。

3.ARPE-19細胞形態(tài)學(xué)觀察：將細胞接種于6孔板，每孔1×104個細胞密度，分組培養(yǎng)72h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗2次后，40g/L多聚甲醛固定10min后，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

4.吖啶橙-溴乙錠染色法檢測細胞凋亡：細胞處理方法同上。按照試劑盒操作，6孔板中每孔加100μl Buffer稀釋液，每孔再加5μl吖啶橙和5μl溴乙錠，混勻，室溫避光孵育5min后，棄上清，PBS洗兩次，熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件對圖片細胞計數(shù)。

5.細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平測定：按照每孔2×104個細胞接種于96孔板，分組培養(yǎng)72h后。DCFH-DA法檢測ROS含量，根據(jù)活性氧測定試劑盒說明書各組取100μl細胞懸液，加入10μmol/L的DCFH-DA，每孔100μl，37℃避光孵育30 min后，消化后收集細胞沉淀，預(yù)冷PBS重懸細胞，酶標儀525nm波長檢測吸光度(A)值，計算ROS水平。按照GSH-Px檢測試劑盒說明書的反應(yīng)體系每組200μl細胞懸液中依次加入GSH標準品應(yīng)用液和標準液，混勻，室溫靜置15min,412nm波長測定每間隔2min時的A值，根據(jù)標準曲線計算細胞內(nèi)GSH-Px活力。

6.Western blot法檢測京尼平對細胞中Nrf2/HO-1通路蛋白的影響：對數(shù)生長期ARPE-19細胞接種到100mm培養(yǎng)皿，加入10ml培養(yǎng)基，1×105個/毫升密度分組培養(yǎng)72h，提取各組總蛋白，蛋白定量后，每孔以20μg樣品上樣，電泳濃縮膠75V、30min，分離膠110V、60min，4℃轉(zhuǎn)膜100min，5% 脫脂奶粉室溫封閉90min，加入抗β-actin、Nrf2和HO-1抗體(濃度均為1∶1000)，4℃孵育過夜，1∶5000的二抗37℃孵育1.5h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Image J凝膠圖像分析各蛋白相對表達量。

結(jié) 果

1.倒置顯微鏡下觀察京尼平對ARPE-19細胞形態(tài)影響:正常糖對照組的 ARPE-19 細胞呈長梭形，單層伸展貼壁生長，鑲嵌式排列，邊界清晰，形態(tài)規(guī)整，分布均勻，狀態(tài)良好(圖1A)；模型組細胞梭形扭曲改變，部分縮小變圓，邊界不清，鑲嵌式排列雜亂，細胞密度較低，生長狀態(tài)不佳(圖1B)；京尼平組圓形皺縮細胞明顯少于模型組，改善了細胞形態(tài)(圖1C)；抑制劑組形態(tài)異常細胞較模型組少(圖1D)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察各組ARPE-19細胞形態(tài)(×100)A.對照組；B.模型組；C.京尼平組；D.抑制劑組

2.AO/EB染色法檢測細胞凋亡：空白對照組細胞呈均勻綠色熒光；模型組紅色熒光逐漸增強，合并后的圖像可見橘紅色熒光增加，細胞密度也出現(xiàn)了減少；京尼平組細胞形態(tài)接近對照組，細胞數(shù)量增加，紅色熒光變?nèi)?，合并后也呈較弱的橘紅色熒光，抑制劑組橘紅色熒光比模型組減弱。根據(jù)橘紅色熒光染色的細胞比例計算細胞凋亡率(圖2)。

圖2 吖啶橙-溴乙錠染色觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與京尼平組比較，**P<0.05

3.京尼平對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響：與正常糖對照組比較，模型組由高糖和缺氧誘導(dǎo)損傷產(chǎn)生ROS水平明顯增加，GSH-Px活力降低(P<0.05)。與模型組比較，京尼平組ROS水平顯著降低，GSH-Px活力增加(P<0.05)，而抑制劑組比京尼平組ROS水平增加，GSH-Px活力下降(P<0.05，表1)。

表1 京尼平對各組ARPE-19細胞ROS水平和GSH-Px活力的影響

4.京尼平對各組細胞Nrf2和HO-1蛋白表達的影響：模型組細胞中Nrf2和HO-1蛋白水平低于對照組；京尼平組Nrf2和HO-1蛋白水平高于模型組；而抑制劑組與京尼平組比較降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3、表2)。

圖3 京尼平對各組ARPE-19細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

表2 京尼平對各組ARPE-19細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

討 論

DR是糖尿病患者常見易發(fā)的微血管病變，主要特征是高糖環(huán)境和部分微血管閉塞導(dǎo)致缺氧，其病理改變過程中與細胞氧化損傷密切相關(guān)[7,8]。抑制視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE)氧化應(yīng)激損傷，研究天然有效抗氧化劑成為防治DR的一個新途徑。京尼平是傳統(tǒng)中藥梔子、杜仲等植物中提取的有效抗氧化劑，是一種特異的羥基清除劑，能有效清除活性氧和自由基，具有多重抗氧化應(yīng)激和保護線粒體功能的作用，已經(jīng)證明在防治糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)損害、心肌病變、腎病及心血管系統(tǒng)疾病等多種病癥中，可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護作用[9～12]。

體外模擬DR相似的病理環(huán)境，建立高糖缺氧的ARPE-19細胞氧化損傷模型，分析京尼平對細胞的抗氧化損傷作用和機制。利用倒置顯微鏡觀察到模型組細胞密度小，生長狀態(tài)差，京尼平組明顯改善了高糖缺氧環(huán)境的細胞形態(tài)。通過AO/EB染色檢測到模型組橘紅色熒光明顯增強，細胞凋亡率明顯上升，京尼平組的細胞凋亡率卻明顯下降，說明京尼平可以抑制細胞凋亡。ROS是含氧活性分子的總稱，對調(diào)節(jié)細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、免疫應(yīng)答及信號傳遞等有重要調(diào)節(jié)作用，細胞在正常生理狀態(tài)下釋放較少[13,14]。氧化還原系統(tǒng)失衡時生成大量ROS，過多會破壞線粒體呼吸鏈引起細胞能量代謝障礙，促進細胞凋亡，是細胞氧化應(yīng)激損傷的標志性事件。GSH-Px是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化還原平衡狀態(tài)的重要內(nèi)源性抗氧化酶，能解除過氧化物毒性，分解過氧化氫[15]。

本實驗檢測到模型組細胞在高糖缺氧的環(huán)境下ROS含量明顯增強，GSH-Px活力下降，京尼平處理后ROS含量則明顯下降，GSH-Px活力增大，說明京尼平對氧化應(yīng)激損傷的細胞具有明顯的保護作用。細胞抗氧化系統(tǒng)失衡會促進凋亡調(diào)控信號因子的合成和釋放，其中Nrf2是內(nèi)源性氧化應(yīng)激通路的重要調(diào)節(jié)因子，在維持氧化還原平衡方面擔(dān)任主要的角色[16]。正常狀態(tài)時，Nrf2在細胞質(zhì)內(nèi)與Keap-1結(jié)合，在氧化應(yīng)激狀態(tài)時，活化Nrf2，與Keap-1解離，進入細胞核，與抗氧化劑反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，調(diào)控下游抗氧化蛋白HO-1，催化血紅蛋白降解，形成內(nèi)源性抗氧化保護系統(tǒng)，減弱氧化應(yīng)激，同時抑制促凋亡蛋白酶[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，京尼平能增加缺氧和高糖環(huán)境中細胞質(zhì)內(nèi)Nrf2和HO-1的表達量，而加入Nrf2抑制劑后細胞質(zhì)內(nèi)Nrf2和HO-1卻明顯降低，說明一定濃度的京尼平可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路維持氧化還原狀態(tài)的平衡，減少氧化應(yīng)激損傷，為抗氧化劑防治糖尿病視網(wǎng)膜病提供理論基礎(chǔ)。