申永剛1，高匯雯，胡昕偉，李汶鴻3，何靜，張雪飛，王涵，丁圣剛3，沈兵

(1. 安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院護(hù)理系內(nèi)兒教研室，安徽 池州 247099；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032；3. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 合肥 230022)

瞬時(shí)受體電位多囊蛋白2(transient receptor potential polycystic 2，TRPP2)在平滑肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流[1]。鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)參與細(xì)胞鈣信號(hào)的傳輸，一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣儲(chǔ)備耗盡，位于細(xì)胞膜上的某些鈣通道將被刺激打開，從而允許鈣離子滲透[2]。作為常見和發(fā)病率不斷增加的呼吸系統(tǒng)疾病之一，哮喘的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有待深入研究[3]，但氣道平滑肌細(xì)胞的變化引起哮喘發(fā)作的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬對(duì)大鼠造模后，進(jìn)行氣管張力等研究，試圖闡明哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞中TRPP2的表達(dá)量變化及其對(duì)氣管收縮過程的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 維拉帕米(Verapamil)購(gòu)自西亞試劑(批號(hào)：I41674)，卡巴膽堿(Carbachol)購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社(批號(hào)：HXXJE-BE)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)：102329400)；TRPP2抗體購(gòu)自北京博奧森公司；Krebs溶液配方為118 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、4.7 mmol/L KCl、25.2 mmol/L NaHCO3、11.1 mmol/L glucose、1.2 mmol/L KH2PO4、1.2 mmol/L MgSO4·7H2O，持續(xù)通入95% O2和5% CO2；將等摩爾的NaCl替換為KCl并使KCl終濃度達(dá)到60 mmol/L即為高鉀溶液。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 均為雄性SD大鼠，體重(200～220) g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010。

1.2方法

1.2.1哮喘造模 先適應(yīng)性飼養(yǎng)10只同周齡雄性大鼠7 d，然后將其隨機(jī)分為對(duì)照組和哮喘組。參照楊飛等[4]的造模方法，造模時(shí)長(zhǎng)共為20 d，哮喘組大鼠在第1天、第8天腹腔注射致敏液，致敏液現(xiàn)配現(xiàn)用，配方為每1 ml無(wú)菌PBS中加入4%卵清蛋白粉末和1% Al(OH)3凝膠，對(duì)照組使用無(wú)菌PBS溶液做對(duì)照試驗(yàn)；在實(shí)驗(yàn)第15～20天每日固定時(shí)間對(duì)大鼠進(jìn)行霧化吸入實(shí)驗(yàn)，每日30 min，對(duì)照組吸入無(wú)菌PBS溶液，哮喘組吸入現(xiàn)配現(xiàn)用的致敏液，霧化吸入的致敏液配方為1%卵清蛋白溶液。

1.2.2HE染色 將大鼠采用CO2窒息處死后，迅速取出兩側(cè)肺臟，用PBS沖洗干凈后，予以4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，再脫水后進(jìn)行石蠟包埋，最后切片和進(jìn)行HE染色，觀察對(duì)照組與哮喘組肺組織結(jié)構(gòu)的差異。

1.2.3氣管環(huán)的制備 克氏液需提前滅菌，并通入95% O2和5% CO2的混合氣體。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用二氧化碳窒息法處死，解剖并盡快取出大鼠氣管，取出的氣管放入無(wú)菌克氏液中。借助解剖顯微鏡，切除氣管周圍的多余結(jié)締組織后，將氣管小心剪成氣管環(huán)備用。

1.2.4氣管組織轉(zhuǎn)染 取所需體積的DEPC水于TRPP2 siRNA、siRNA NC干粉，配成轉(zhuǎn)染保存液，并分裝保存，防止因反復(fù)凍融對(duì)實(shí)驗(yàn)效率帶來(lái)的影響?？焖偃〕稣４笫蟮臍夤墉h(huán)后，用無(wú)菌克氏液洗氣管3遍后將氣管放入12孔板中，每孔加入0.9 ml無(wú)血清高糖培養(yǎng)基。取Lipofectamine TM 3000 1 μl和Opti-MEM 49 μl混勻于離心管內(nèi)，取配好的siRNA保存液5 μl和Opti-MEM 45 μl混勻于另一離心管內(nèi)，室溫將兩支離心管靜置5 min，然后將裝有siRNA保存液加入含有Lip 3000的溶液中混勻，等待15 min后，將混合液以一定比例加入培養(yǎng)基中，放置在二氧化碳濃度為5%，溫度恒定為37 ℃的環(huán)境中8 h。最后換入完全培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.5離體氣管張力實(shí)驗(yàn) 向浴槽中加入5 ml的克氏液，然后提前向其中通入混合氣體，小心將氣管環(huán)轉(zhuǎn)移至氣管張力實(shí)驗(yàn)儀器上，并及時(shí)浸泡在浴槽內(nèi)，將氣管環(huán)前負(fù)荷調(diào)整至1 g；張力換能器與實(shí)時(shí)記錄數(shù)據(jù)的BL-420N系統(tǒng)連接，組織需在浴槽中穩(wěn)定>40 min，克氏液每10 min換入新的。前負(fù)荷恒定時(shí)，加入高鉀溶液來(lái)使氣管環(huán)收縮。待收縮穩(wěn)定并記錄數(shù)值，再換入克氏液洗去高鉀對(duì)氣管帶來(lái)的收縮效應(yīng)，重復(fù)洗3次后，讓氣管浸泡于克氏液中平衡20～30 min。再加入卡巴膽堿和維拉帕米試劑，二者在克氏液中終濃度均為1 μmol/L，等待其收縮15～20 min并穩(wěn)定，直接加入CaCl2溶液濃度梯度，記錄氣管收縮情況。

1.2.6Western Blot實(shí)驗(yàn) 加入合適量的裂解液，研磨組織制樣，全程在冰上進(jìn)行。研磨完成后為減少蛋白的降解，于4 ℃離心提取上清，煮樣后獲得蛋白樣本。盡快使用蛋白樣本進(jìn)行電泳，采用濕法轉(zhuǎn)膜，將含有蛋白的PVDF膜予以封閉。序貫進(jìn)行一抗、二抗孵育后，用漂洗液洗去二抗，加入適量顯影液，曝光并拍攝。

1.2.7免疫組化實(shí)驗(yàn) 取大鼠肺組織石蠟切片，加3%H2O2降低內(nèi)源性酶對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響，修復(fù)抗原，封閉，然后依次進(jìn)行一抗、二抗孵育與DAB顯色等[5]。棕黃色是陽(yáng)性結(jié)果的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由Image-pro Plus 5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用GraphPad分析軟件統(tǒng)計(jì)，兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，若P<0.05則結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)改變 對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)明顯改變，哮喘組大鼠出現(xiàn)呼吸點(diǎn)頭有明顯聲音、打噴嚏動(dòng)作明顯、不斷抓鼻孔、腹肌有明顯抽動(dòng)等哮喘表現(xiàn)。

2.2HE染色 對(duì)照組大鼠肺部無(wú)炎癥細(xì)胞聚集，無(wú)明顯的炎癥改變，肺泡完整，如圖1A；哮喘組大鼠肺內(nèi)有大量炎性細(xì)胞聚集，肺泡破裂不完整，如圖1B。

圖1 大鼠肺部蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果(×100)

2.3SOCE引起的大鼠氣管收縮在哮喘中的變化 相比于對(duì)照組大鼠，高鉀所引起氣管收縮的哮喘組大鼠中SOCE引起的氣管收縮占的百分比明顯增高(P<0.05)，見圖2。

2.4TRPP2蛋白在哮喘組氣管中表達(dá)變化 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3A、圖3B，與對(duì)照組相比，哮喘組大鼠氣管平滑肌組織TRPP2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。免疫組化結(jié)果也表明，相比對(duì)照組大鼠，哮喘組大鼠氣管平滑肌細(xì)胞TRPP2蛋白表達(dá)量明顯升高(見圖3C、圖3D)，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：*表示P<0.05。

注：*表示P<0.05。

2.5TRPP2 siRNA轉(zhuǎn)染后大鼠氣管SOCE引起的收縮變化 TRPP2 siRNA轉(zhuǎn)染正常大鼠氣管后，Western Blot檢測(cè)大鼠氣管組織TRPP2蛋白含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組TRPP2蛋白含量明顯低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組，如圖4A所示。對(duì)轉(zhuǎn)染后的氣管環(huán)做氣管張力實(shí)驗(yàn)，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，SOCE引起的氣管收縮占高鉀引起收縮的百分比在轉(zhuǎn)染組中明顯降低(P<0.05)，結(jié)果如圖4B所示。轉(zhuǎn)染對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組高鉀引起的氣管收縮分別為(0.87±0.50) g和(0.84±0.38) g，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明轉(zhuǎn)染后氣管環(huán)的活力可維持后續(xù)檢測(cè)。

3 討論

哮喘的頻繁發(fā)作會(huì)引起氣管平滑肌增生，從而導(dǎo)致平滑肌收縮增強(qiáng)和氣道變窄，最終引起氣道高反應(yīng)，如何控制哮喘時(shí)劇烈的氣道收縮成為研究熱點(diǎn)[6-7]。TRPP2由PKD2基因編碼，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中大量表達(dá)并充當(dāng)鈣釋放通道，同時(shí)參與平滑肌收縮[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPP2在消化道平滑肌的表達(dá)與平滑肌的收縮具有相關(guān)性[9]。在本研究中，哮喘大鼠氣管組織TRPP2蛋白表達(dá)明顯升高，且免疫組化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，升高的TRPP2蛋白主要由于氣管平滑肌的表達(dá)顯著增高，這表明哮喘可以通過影響TRPP2蛋白在氣管平滑肌中的含量參與哮喘的發(fā)生。

注：*表示P<0.05。

SOCE主要是由于細(xì)胞鈣庫(kù)中Ca2+缺乏，細(xì)胞外Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，以彌補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)鈣的缺乏。越來(lái)越多的研究表明，疾病時(shí)SOCE參與氣道平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥的發(fā)生[10-11]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過將離體氣管環(huán)孵育在無(wú)鈣的克氏液中，并加入卡巴膽堿和維拉帕米排空細(xì)胞內(nèi)鈣，最后加入CaCl2溶液梯度引起氣管收縮，此時(shí)的收縮即為SOCE介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哮喘大鼠氣管平滑肌有更強(qiáng)的SOCE。為進(jìn)一步探究TRPP2蛋白與SOCE通道的相關(guān)性，本研究對(duì)正常大鼠的離體氣管組織轉(zhuǎn)染TRPP2 siRNA以敲低氣管組織中TRPP2蛋白的表達(dá)，敲低后的氣管環(huán)相比轉(zhuǎn)染siRNA NC的對(duì)照組SOCE明顯降低，表明TRPP2蛋白會(huì)影響氣管組織的鈣離子內(nèi)流。同時(shí)TRPP2 siRNA轉(zhuǎn)染后通過Western Blot法檢測(cè)也證實(shí)氣管組織中TRPP2蛋白顯著降低，達(dá)到了敲低TRPP2的目的，而且也沒有顯著影響高鉀溶液引起的氣管收縮，說(shuō)明siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)氣管活力影響不大。

綜上所述，大鼠氣道平滑肌TRPP2的表達(dá)改變可能會(huì)通過SOCE引起氣管收縮功能變化。此發(fā)現(xiàn)可提供給哮喘治療新的有效治療途徑與藥物作用靶點(diǎn)。