劉玥彤楊鎏鑫黃清歐陽揚劉蕾陳玉珍方子文蒙蘭青

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，廣西 百色 533000；3. 廣東省粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關 512000)

卒中，中醫(yī)又叫中風，是全球第二大致死和致殘原因[1]，是中國第三大死因，2018年中國卒中死亡人數(shù)為157萬，給中國的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了巨大的負擔[2]。缺血性腦卒中占卒中70%～80%，對缺血性腦卒中有效治療的研究是目前卒中關注的熱點之一。中藥是祖國醫(yī)學的瑰寶，幾千年的醫(yī)學實踐發(fā)現(xiàn)中藥在治療中風方面具有獨特療效[3-5]。三七、黃芪、丹參為治療淤血癥著名的單味中藥，是復方藥血栓通膠囊和芪參益氣方的重要組成成分，研究[6-8]表明其配伍使用對缺血性腦卒中的治療有著重要影響，對于缺血性腦卒中具有神經保護作用[9-10]，但作用機制目前尚未明確。網絡藥理學是運用系統(tǒng)生物學、網絡分析對藥物進行設計分析的一種方法，具有連通性、冗余性和多效性[11]。同時將藥理學網絡映射到人類疾病-基因網絡上，不僅揭示了藥物的作用靶點，而且可以對藥物靶點涉及的多種疾病有所了解[12-13]。在目前國內外研究中，網絡藥理學已廣泛應用于中藥活性成分及靶點的預測、藥物與疾病之間相互作用的預測等。本研究將通過網絡藥理學以及GEO數(shù)據，探索中藥三七、黃芪、丹參防治缺血性腦卒中的作用機制，為中藥在缺血性腦卒中的臨床應用提供理論依據，流程圖見圖1。

圖1 基于網絡藥理學和GEO數(shù)據研究三七、黃芪

1 資料與方法

研究中藥活性成分相關靶點以及與缺血性腦卒中疾病靶點相互作用中需要用到的工具，見表1。

表1 常用數(shù)據庫以及軟件

1.1三七、黃芪和丹參化學成分的檢索與篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學TCMSP數(shù)據庫(https://tcmsp-e.com/)分別檢索三七、黃芪以及丹參獲得所有化學成分，根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，化合物類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，將三七、黃芪以及丹參符合篩選標準的化學成分信息作為活性成分。并通過查閱相關文獻獲取有效活性成分作為補充。

1.2三七、黃芪和丹參活性成分靶點信息的獲取 在TCMSP數(shù)據庫獲取與活性成分相關的作用靶點蛋白信息，通過Uniprot數(shù)據庫(https://www.uniprot.org/)進行蛋白質ID轉換。采用Cytoscape 3.8.0軟件 (https://cytoscape.org/)構建三七、黃芪以及丹參與其作用靶點網絡圖。

1.3缺血性腦卒中疾病靶點信息的檢索與收集 在OMIM數(shù)據庫(https://omim.org/)和GeneCards綜合數(shù)據庫(https://www.genecards.org/)檢索ischemic stroke獲取缺血性腦卒中疾病的靶點。合并去重后通過在線工具Veen(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制維恩圖獲取藥物活性成分在疾病中的作用靶點。

1.4中藥-活性成分-作用靶點-疾病相關網絡的構建 將篩選整合得到的三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中疾病中發(fā)揮潛在作用有效成分及相關靶點通過Cytoscape 3.8.0軟件來構建“中藥-活性成分-作用靶點-疾病”相關網絡。

1.5蛋白相互作用(PPI)網絡構建及核心蛋白篩選 將三七、黃芪和丹參有效成分靶點與疾病靶點交集后所得相關的靶點蛋白導入String數(shù)據庫(http://string-db.org)。在String數(shù)據庫中設定物種為“Homo sapiens”(人源)，相關作用最低置信度為“Highest confidence=0.9”，導出蛋白質相互作用網絡圖，并運用Cytoscape 3.8.0軟件中Anlyze Network工具和CytoNCA插件，篩選得到中藥活性成分靶點-疾病網絡中核心模塊和核心蛋白。

1.6GO生物學過程以及KEGG通路富集分析 將核心基因導入DAVID數(shù)據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(gene ontology，GO)中的生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組成(cellular component，CC)分類富集分析和KEGG通路注釋分析，設定閾值為P<0.05作為顯著性標準。利用Bioinformatics在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/?p=4J)進行結果可視化分析。

1.7潛在核心靶點的驗證 在GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據庫搜索關鍵詞“Ischemic Stroke”獲取得到基因微陣列數(shù)據集GSE22255，使用RStudio軟件(https://www.rstudio.com/)進行質量以及數(shù)據可視化分析，以P<0.05且|log2FC|>0.6為標準篩選得到缺血性腦卒中具有差異表達基因(differential expressed genes，DEG)，同時通過string數(shù)據庫以及Cytoscape 3.8.0軟件獲取得到核心差異基因，將其結果與所獲取的三七、黃芪、丹參在IS中作用的潛在核心靶點取交集，來進一步驗證潛在核心靶點的表達。

2 結果

2.1三七、黃芪和丹參活性成分靶點信息 在TCMSP數(shù)據庫中檢索得到三七的化合物共119個，黃芪的化合物共89個，丹參的化合物202個。篩選后得到三七活性成分為13個，黃芪活性成分為21個，丹參活性成分為65個，其中需根據文獻補充三七活性成分notoginsenoside R1、ginsenoside Re、ginsenoside Rb1、ginsenoside Rg1以及ginsenoside Rd，黃芪活性成分Astragaloside IV。在TCMSP數(shù)據庫獲取靶點蛋白信息以及Uniprot數(shù)據庫蛋白質ID轉換后收集得到具有潛在靶蛋白有效活性成分和靶蛋白，具有潛在靶蛋白有效活性成分如表2所示。其中三七有效活性成分相關作用靶點186個，黃芪作用靶點215個，丹參作用靶點137個。構建“中藥-活性成分-相關靶點”網絡，見圖2。

2.2缺血性腦卒中相關靶點的獲取以及三七、黃芪、丹參在其潛在靶點 在OMIM數(shù)據庫和GeneCards綜合數(shù)據庫經檢索分別獲得337個和3937個缺血性腦卒中相關靶點。篩選合并去重后得到IS相關靶點2100個。將三七、黃芪和丹參活性成分相關靶點進行合并去重，通過繪制Veen收集中藥活性成分在IS中的潛在作用靶點160個，見圖3。

圖2 “三七、黃芪和丹參-活性成分-靶點”網絡圖

圖3 三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在靶點Veen圖

2.3“中藥-活性成分-作用靶點-疾病”相關網絡的構建 將三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中作用的有效成分及相關靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建“中藥-活性成分-作用靶點-疾病”相關網絡，見圖4。其中三七和黃芪活性成分含有共同靶點(如圖4中A1所示)。藍色部分為三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中作用靶點，橙色矩形部分為三七在缺血性腦卒中的有效作用成分，粉色三角形部分為黃芪在缺血性腦卒中的有效作用成分，綠色菱形部分為丹參在缺血性腦卒中的有效作用成分。

2.4蛋白相互作用(PPI)網絡構建及核心蛋白篩選結果 將所獲取的三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在160個靶點導入String數(shù)據庫中，將結果保存為TSV格式并導入Cytoscape 3.8.0軟件，得到蛋白互作網絡圖，見圖5。同時通過Cytoscape軟件中cytoNCA插件對網絡中靶點度值(Degree)、介度中心性(Betweenness Centrality，BC)和接近中心性(Closeness Centrality，CC)進行分析篩選得到“中藥活性成分靶點-疾病”網絡中核心蛋白及基本信息，如圖6和表3，其中顏色越深代表靶點度值越大。

圖4 “中藥-活性成分-作用靶點-疾病”網絡圖

圖5 三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在靶點PPI網絡圖

圖6 潛在靶點PPI網絡圖核心蛋白

表3 三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在核心靶點蛋白基本信息

2.5核心靶蛋白GO以及KEGG通路富集 將核心基因導入DAVID數(shù)據庫，進行GO以及KEGG通路富集。根據P-Value<0.05進行篩選后共獲取GO富集條目共105條和KEGG通路70條。其中GO富集中包含生物過程條目80條，分子組分條目6條，分子功能條目19條。同時對GO各分類條目前10名以及KEGG通路前20進行注釋分析，如圖7、圖8所示。在生物學過程中主要為脂多糖介導的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、正向調控基因表達(positive regulation of gene expression)、調控一氧化氮生物合成過程(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)等，分子組分主要富集于核質、胞漿、胞核，分子功能主要是與相同蛋白、蛋白磷酸酶、轉錄調節(jié)區(qū)DNA等結合有關。在對三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在核心靶點KEGG通路富集中包含MAPK信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體(TLR)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、鞘脂信號通路、神經營養(yǎng)因子(BDNF)信號通路、FOXO信號通路等。

圖7 三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在核心靶點GO富集(排名前10)

圖8 三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中潛在核心靶點KEGG通路富集分析(排名前20)

2.6潛在核心靶點驗證 GSE22255數(shù)據集中有40個樣本，來自缺血性腦卒中組(n=20)和對照組(n=20)。使用GEO2R進行在線分析，將篩選得到差異基因在String數(shù)據庫PPI網絡導入Cytoscape 3.8.0軟件中用cytoHubba插件，按照degree篩選得到排名前十的靶基因，如圖9所示，顏色越深表明程度分值越大。與所獲取的三七、黃芪、丹參在IS中作用的潛在核心靶點取交集后得到靶基因轉錄因子AP-1(JUN)、腫瘤壞死因子(TNF)，在GSE22255數(shù)據集卒中組和對照組表達如圖10所示。該結果進一步表明JUN、TNF在缺血性腦卒中發(fā)揮著相關作用，并可能為三七、黃芪、丹參的作用重要靶點。

圖9 GSE22255數(shù)據集PPI網絡中排名前十靶基因

圖10 JUN、TNF分別在數(shù)據集GSE22255中表達

3 討論

三七、黃芪、丹參是我國著名中藥，廣泛應用于缺血性腦卒中的臨床治療[14-16]。梁萍等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)三七可以對急性腦缺血/再灌注損(I/R)傷大鼠神經血管單元的整體保護作用。王萍等[19]研究中發(fā)現(xiàn)三七中皂苷類成分能抑制大鼠缺血性腦卒中模型中巨噬細胞和小膠質細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-6)的表達，減輕炎癥反應從而起到神經保護作用。黃芪甲苷和山萘酚是黃芪的活性成分，研究表明黃芪甲苷可以通過促進自噬抑制細胞凋亡在腦缺血/再灌注損傷中發(fā)揮神經保護作用[20]，山萘酚通過降低TNF-α和 IL-1β減輕炎癥反應，保護血腦屏障完整性，減少腦梗塞體積改善神經損傷。在Lee JC等[21]研究中發(fā)現(xiàn)丹參提取物丹參酮Ⅰ( tanshinone Ⅰ)通過減少缺氧缺血小鼠模型的腦組織梗死灶體積以及防止病灶側神經元死亡從而發(fā)揮神經保護作用。而Hou S等[22]研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物丹酚酸在缺血性腦卒中中可以減少皮層梗死體積，防止細胞凋亡和增加線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)，減輕了對線粒體結構和功能的損害。

通過網絡藥理學分析，本研究發(fā)現(xiàn)中藥三七、黃芪、丹參中豆甾醇(stigmasterol)、槲皮素(quercetin)、異鼠李素(isorhamnetin)、毛蕊異黃酮(calycosin)、丹酚酸(salvianolic acids)、隱丹參酮(cryptotanshinone)等活性成分在缺血性腦卒中疾病中發(fā)揮重要作用。在構建的蛋白相互作用網絡中，信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、轉錄因子AP-1(JUN)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、表皮生長因子受體(EGFR)為三七、黃芪、丹參在缺血性腦卒中疾病中的治療作用中核心潛在靶蛋白。GO富集和KEGG通路富集在脂多糖介導的信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正調控、正向調控基因表達、NO生物合成過程、MAPK信號通路、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、鞘脂信號通路、BDNF信號通路、FOXO信號通路等。豆甾醇為三七的有效活性成分，Sun JD等[23]研究表明豆甾醇可以抑制缺血/再灌注損傷后的自噬作用，降低腦缺血/再灌注損傷后NO水平減輕氧化應激發(fā)應，減少由缺血/再灌注損傷引起的神經功能缺損和梗塞損害，同時能有效地保護損傷后的神經元細胞。在Liang QL等[24]研究中同樣發(fā)現(xiàn)豆甾醇通過調控對腦缺血/再灌注損傷凋亡標志物Bcl-2相關X蛋白(Bax)、半胱天冬酶3(caspase3)、抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達來發(fā)揮抗凋亡作用和NO水平調控發(fā)揮抗氧化作用，并且豆甾醇能在一定程度上緩解炎癥，促進組織抗氧化能力的提高，保護神經元。研究表明黃芪提取物毛蕊異黃酮可以增加缺血性卒中大鼠腦內BDNF及其酪氨酸激酶受體B(TrkB)的表達，從而減少腦梗死體積、神經元變性和凋亡損傷以及含有TNF-α的小膠質細胞的聚集來改善缺血性腦卒卒中神經損傷癥狀[25]。Zhu WX等[26]研究發(fā)現(xiàn)丹參活性成分隱丹參酮可以通過升高缺血性腦卒中中大腦皮層和外周血中B細胞淋巴2(Bcl-2)和NO水平來發(fā)揮抗凋亡和血管保護作用，同時可以增加清除氧自由基的能力指標內源性抗氧化酶(SOD)活性和降低脂質過氧化的敏感指標丙二醛(malonaldehyde，MDA)來發(fā)揮抗氧化作用。除此之外，隱丹參酮可以降低缺血性腦卒中大鼠模型中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)水平的表達，抑制PI3K / AKT信號通路在缺血性腦卒中保護腦組織[26]。槲皮素為三七和黃芪共有的活性成分，Wang YY等[27]研究表明槲皮素可以減輕缺血/再灌注損傷所致的神經功能缺損、腦梗死、血腦屏障破壞、氧化應激、TNF-α和IL-1β的表達，以及凋亡的caspase3活性。在Yao R等[28]研究中發(fā)現(xiàn)槲皮素可能將通過BDNF-TrkB-PI3K/Akt信號通路來能減少大鼠局灶性腦缺血后的細胞凋亡保護腦組織。

通過與GEO數(shù)據庫中缺血性腦卒中GSE22255數(shù)據集的結合，更進一步證明JUN、TNF為缺血性腦卒中關鍵核心靶蛋白，并可能成為三七、黃芪、丹參在缺血性作用的重要靶點。轉錄因子活化蛋白1(AP-1)家族蛋白是基本的亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子，涉及多種細胞過程的調控，包括增殖和存活、生長、分化、凋亡、細胞遷移和轉化，Jun蛋白是其中的成員，包含c-jun、junB、junD[29]。Xiao P等[30]實驗表明腦缺血再灌注過程中，神經細胞中c-Jun的表達是增加的，并且與抗凋亡蛋白Bcl-2/促凋亡蛋白Bax的變化同步。張路等[31]研究表明三七成分三七皂苷可通過抑制c-jun的表達來降低缺血再灌后腦細胞凋亡。而丹參、黃芪以及配伍使用均能夠部分抑制FOS蛋自、JUN蛋白的高表達，對腦缺血再灌注損傷起到保護作用[32]。腫瘤壞死因子(TNF)超家族是由19個配體和29個受體組成，在炎癥、細胞增殖、凋亡和形態(tài)發(fā)生中的作用，其中TNF-α與神經系統(tǒng)也有著密切的關聯(lián)[33]。在神經系統(tǒng)常見疾病缺血性腦卒中中，TNF對再灌注損傷所引起的炎癥反應具有一定的調節(jié)作用[34-35]。而三七、黃芪、丹參中的活性成分均能夠通過調節(jié)缺血/再灌注損傷中TNF的表達來保護神經功能[25-27]。

綜上所述，網路藥理學為中藥在缺血性腦卒中的研究提供了新的方法。本研究通過結合GEO數(shù)據進行生物信息學分析篩選得到三七、黃芪、丹參中潛在核心靶蛋白STAT3、AKT1、JUN、TP53、TNF、MAPK1、MAPK14、EGFR可通過MAPK、T細胞受體、TLR、TNF、FOXO等信號通路調控基因表達、轉錄等多途徑在缺血性腦卒中發(fā)揮神經保護作用，其中JUN、TNF為缺血性腦卒中關鍵核心靶蛋白。由于網絡藥理學是根據在線數(shù)據庫所獲取的大數(shù)據進行分析，其數(shù)據的實時性和及時性存在局限性，后期的研究將通過實驗進一步驗證。