汪進(jìn)城，張磊，許培權(quán)2，祝景偉3，張杰

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233099；3. 蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蚌埠 233030)

乳腺癌是一種高發(fā)且長期困擾女性生命健康的惡性腫瘤，據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，乳腺癌在女性惡性腫瘤新發(fā)病例占所有女性新發(fā)腫瘤疾病的30%左右，其致死率位于第二位，且乳腺癌的發(fā)病率逐年增加。三陰性乳腺癌(tripele negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的亞型之一，是孕激素受體基因、雌激素受體基因以及人類表皮生長因子受體2基因均缺失的一類乳腺癌[1]。相比于其他亞型，TNBC亞型的乳腺癌具有極高的復(fù)發(fā)性、耐藥性以及轉(zhuǎn)移性等特點(diǎn)，導(dǎo)致乳腺癌患者有較低的中位生存率和總生存率[2]。目前中國范圍內(nèi)2020年有超過42萬例女性患者，盡管化療、手術(shù)治療是TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，相比于其他乳腺癌類型，三陰性乳腺癌具體的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，迫切需要更多的研究來闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，為尋找新的乳腺癌的診斷及治療提供新策略。

眾多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤的發(fā)生、耐藥以及侵襲等過程占據(jù)著重要作用。miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈RNA分子。既往研究顯示miRNA可參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、代謝及凋亡等生物學(xué)過程[3]。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)miRNA-506是miRNA調(diào)控當(dāng)中的一個(gè)關(guān)鍵miRNA，miRNA-506通過調(diào)控不同的靶基因之間的結(jié)合，從而抑制或者促進(jìn)某些靶基因的表達(dá)，表現(xiàn)為在不同類型的腫瘤(卵巢癌、肺癌等)的微環(huán)境發(fā)揮抑癌基因的功能[1，4]，在腫瘤增殖和侵襲方面發(fā)揮著極為重要的作用。然而，有關(guān)miRNA-506在TNBC的研究報(bào)道極少。本研究旨在探討miRNA-506在TNBC中的表達(dá)及對其增殖和侵襲作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織來源 所有收集的患者標(biāo)本手術(shù)前均確診為TNBC，患者均未接受化療、放療等治療，獲得乳腺癌患者的知情同意書，并通過蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會的審批。乳腺組織標(biāo)本來自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科和蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤外科2019年10月—2021年6月接受手術(shù)切除治療的TNBC患者的手術(shù)標(biāo)本及取自距離TNBC組織邊緣≥5 cm且與腫塊不在同一象限的癌旁組織各100例，再取乳腺纖維腺瘤組織100例，將所取術(shù)后TNBC組織及配對的癌旁組織、乳腺良性病變組織一部分迅速放置于液氮保存，另一部分行常規(guī)免疫組化。

1.1.2細(xì)胞來源 人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和人正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100細(xì)胞均購自上?？茖W(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.3主要試劑材料 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司(批號：RR037A)；Real-time PCR試劑盒、PureLinkTMRNA小提試劑盒均購自美國賽默飛公司(批號：4371435，12183016)；CCK8試劑盒購自北京索萊寶公司(批號：CA1210)；Lipofect amine 2000 reagent 購自美國Invitrogen公司(批號：11668030)；Transwell小室購自美國corning(批號：CLS3470)。

1.1.4主要儀器 實(shí)時(shí)熒光PCR儀購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher公司；熒光倒置顯微鏡購自日本 OLYMPUS 公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國ThermoFisher公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞和人正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5%CO2以及濕度保持在95%的恒溫恒濕無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，MDA-MB-231細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，生物安全柜內(nèi)用胰酶消化液處理消化細(xì)胞，每隔1 d傳代1次。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照RNA快速提取試劑盒說明書從收集的TNBC組織、乳腺良性病變組織以及癌旁組織樣本提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA溶液OD260nm/OD280nm的吸光度值，計(jì)算RNA的純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將定量的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用10 μl逆錄轉(zhuǎn)反應(yīng)體系：RNA sample 5.0 μl，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μl，RT Primer 0.5 μl，5×Prime Script Buffer2 2.0 μl，RNase Freed H2O 2.0 μl，37 ℃條件下反應(yīng)15 min，85 ℃條件下5 s，反應(yīng)產(chǎn)物4℃條件下保存，接著使用Real-time PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，所有反應(yīng)均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，每孔采用10 μl反應(yīng)體系：2×SYBR Green 5 μl，Primer mix 0.8 μl，DNase-free Water 3.7 μl ，RT product 0.5 μl。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。其中miRNA-506上游引物：5′-TGCGGTAAGGCACCCTTCTGAGTAG-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miRNA-506 mimics上游引物：5′-TAAGGCACCCTTCTGAGTAGA-3′，下游引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6上游引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。上述引物設(shè)計(jì)與合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和人正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100細(xì)胞消化后，接種于6孔板中等待細(xì)胞貼壁，融合密度約70%，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。倒掉6孔板中的舊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染期間使用opti-MEM進(jìn)行培養(yǎng)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書對乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別設(shè)置 NC組、miRNA-506 mimics組。轉(zhuǎn)染6 h后，更換成正常的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，總共培養(yǎng)48 h后進(jìn)行下面的操作。

1.2.4CCK8檢測乳腺癌細(xì)胞增殖 將對數(shù)期生長期的MDA-MB-231細(xì)胞懸液以每孔1×105個(gè)/毫升細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中 ，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。根據(jù)1.2.3操作轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，每孔加10 μl 的CCK-8試劑溶液后，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長下測定其吸光度。

1.2.5Transwell檢測細(xì)胞侵襲 取經(jīng)過1.2.3操作轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，將各組不同處理的細(xì)胞使用胰蛋白酶消化液處理，將其制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/毫升，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞接種到鋪著Matrigel膠的Transwell小室的上室，600 μl的10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基放在下室，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸走上室中的培養(yǎng)液，用棉簽小心擦去多余的Matrigel膠和未遷移的細(xì)胞，加入無水甲醇固定25 min，然后結(jié)晶紫溶液染色25 min，在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1TNBC組織中miRNA-506表達(dá)水平 如圖1所示，與正常癌旁組織相比，TNBC癌組織miRNA-506表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，乳腺良性病變組織miRNA-506表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與癌旁組織相比，**P<0.01。

2.2TNBC細(xì)胞系miRNA-506表達(dá)水平 如圖2所示，與正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100組相比，TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231組miRNA-506表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與HBL-100組相比，**P<0.01。

2.3miRNA-506對TNBC細(xì)胞增殖的影響 如表1所示，與轉(zhuǎn)染miRNA-506 NC組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-506 mimics組12 h、24 h、48 h組細(xì)胞活力(OD值)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 兩組細(xì)胞活力比較

2.4miRNA-506對TNBC細(xì)胞侵襲的影響 如圖3所示，與轉(zhuǎn)染miRNA-506 NC組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-506 mimics組48 h細(xì)胞侵襲率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與miRNA-506 NC組相比，**P<0.01。

3 討論

隨著各國學(xué)者對miRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為的研究已經(jīng)愈演愈烈，miRNA在癌癥發(fā)生、發(fā)展、耐藥等方面的研究已成為熱點(diǎn)。在腫瘤微環(huán)境下，miRNAs控制人類二分之一基因的miRNA表達(dá)進(jìn)而調(diào)控著抑癌基因和促癌基因。最近的miRNA研究集中在各種高通量生化篩選上，這些篩選可測量1000多種人類miRNA在人類癌癥中的表達(dá)。數(shù)百個(gè)miRNA 被定位到癌癥基因組中的改變區(qū)域。miRNAs在發(fā)育過程中的正常干細(xì)胞功能中也起著關(guān)鍵作用，并已成為癌癥干細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子[5]。研究表明，使用miRNA替代或抗miRNA技術(shù)對癌細(xì)胞中特定miRNA改變的調(diào)節(jié)可恢復(fù)miRNA活性并修復(fù)影響凋亡信號通路或藥物敏感性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并改善治療結(jié)果[6]，miRNA的過表達(dá)或缺失在驅(qū)動人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色。

miRNA-506定位于X染色體。迄今為止，對miRNA-506的研究很少，因此對其在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用仍知之甚少。在非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miRNA-506能夠通過Bax/Bcl-2/MCL-1途徑抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)凋亡[7]。此外，miRNA-506可以通過抑制 PPARa表達(dá)來誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞對羥基喜樹堿的抗性[8]。上述研究表明miRNA-506在肺癌和結(jié)直腸癌環(huán)境中充當(dāng)腫瘤抑制基因。然而，在黑色素瘤患者中miRNA-506的高表達(dá)與黑色素瘤的惡性程度呈正相關(guān)，抑制miRNA-506表達(dá)可顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，降低其侵襲性和集落形成能力[9]，表明miRNA-506可以充當(dāng)促癌基因。綜合以上研究

表明miRNA-506在不同的腫瘤中可能扮演不同的角色，其原因可能與癌癥的病理分期以及腫瘤類型密切相關(guān)。新近研究通過功能蛋白質(zhì)組學(xué)在多個(gè)細(xì)胞系中篩選miRNA文庫并整合來自乳腺和卵巢腫瘤的數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-506能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制因子如 p27/myc/phospho-Rb 蛋白[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-506在TNBC中的表達(dá)較低，以及過表達(dá)TNBC細(xì)胞內(nèi)的miRNA-506可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲、遷移，豐富了miRNA-506在TNBC細(xì)胞方面認(rèn)識，為未來靶向miRNA-506提供理論基礎(chǔ)。