(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

胰腺癌惡性程度高，死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，在癌癥總死亡率中占比高達(dá)8%[1]。尋找胰腺癌診治的新靶點(diǎn)，將可能為患者的診治提供新思路。近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA-125a-5p 通過靶向TP53[2]、CD147[3]、BRMS1[4]、STAT3[5]、BAP1[6]、TAZ[7]等因子，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖凋亡及侵襲遷移等過程。目前miRNA與胰腺癌的關(guān)系已經(jīng)成為各學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-125a-5p在胰腺癌外周血、組織及細(xì)胞系中高表達(dá)[8-9]，與胰腺癌關(guān)系密切。本研究通過構(gòu)建miRNA-125a-5p過表達(dá)和低表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株，并建立胰腺癌皮下移植瘤模型，檢測(cè)Caspase-8表達(dá)情況，分析miRNA-125a-5p與胰腺癌皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)BALB/C雄性裸鼠18只，體重18～22 g，4～6周齡，購于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0001。胎牛血清購于Gibco公司。人胰腺癌PANC-1細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，構(gòu)建miRNA-125a-5p過表達(dá)及miRNA-125a-5p低表達(dá)慢病毒載體，并完成包裝、滴度的測(cè)定(載體類型：GV慢病毒載體系列，熒光標(biāo)記：EGFP)。G418(遺傳霉素)購于上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。PCR引物合成(上海生工生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司(B532451)，SYBR試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司(11201ES03)。兔單克隆Caspase-8一抗購于Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 PANC-1細(xì)胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，使用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。將PANC-1細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至50%～60%融合度時(shí)，將miRNA-125a-5p過表達(dá)及低表達(dá)慢病毒加入孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染12 h更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后開始表達(dá)紅色熒光，72 h熒光表達(dá)最強(qiáng)，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率，最后用遺傳霉素進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選。

1.3裸鼠皮下移植瘤模型的建立 接種細(xì)胞前，在右前肢腋窩靠近背部皮下進(jìn)行消毒處理，將1×107個(gè)細(xì)胞溶于0.2 ml生理鹽水中，用注射器抽取細(xì)胞懸液接種于皮下，分別接種miRNA-125a-5p過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞、miRNA-125a-5p低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞及PANC-1細(xì)胞。觀察成瘤情況，4周后處死裸鼠，取出腫瘤后立即放置液氮中，隨后放入-80 ℃保存。

1.4RT-qPCR驗(yàn)證miRNA-125a-5p轉(zhuǎn)染效果及胰腺癌皮下移植瘤Caspase-8表達(dá)水平 用Trizol提取組織總RNA后，無酶水溶解，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。取適量RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以β-actin、U6作為內(nèi)參。miRNA-125a-5p引物序列：上游5′-CGTCCCTGAGACCCTTT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。U6引序物列：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。Caspase-8 引物序列：上游5′-CAATCTCCACAAGTTGCTCA-3′，下游5′-GGGATAGATAATTTAGGAGTGGG-3′。Β-actin 引物序列：上游5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游5′-ATCAA-CGCAATGTGGGAAA-3′。應(yīng)用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μl，上游引物0.4 μl，下游引物 0.4 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，加ddH2O至20 μl，所有樣品均為3個(gè)復(fù)孔，在PCR擴(kuò)增儀上完成，記錄循環(huán)閾值，采用2-△△Ct方法，算出目的基因miRNA-125a-5p、Caspase-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western Blot檢測(cè)Caspase-8蛋白表達(dá) 在研磨碗中加入裂解液充分裂解腫瘤組織，提取總蛋白，應(yīng)用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并計(jì)算上樣量；10%凝膠電泳，采用PVDF膜轉(zhuǎn)膜；封閉1h；加入Caspase-8一抗，4 ℃孵育過夜；第2天加入二抗，室溫孵育2 h；TBST漂洗3次；顯影，保存條帶圖片。使用Image J軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算各蛋白表達(dá)量(目的蛋白條帶吸光度值/內(nèi)參照條帶吸光度值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

2 結(jié)果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染情況 培養(yǎng)PANC-1細(xì)胞至融合度為50%左右，開始慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為MOI=10時(shí)，轉(zhuǎn)染24 h后，紅色熒光開始表達(dá)，72 h紅色熒光表達(dá)最強(qiáng)，熒光顯微鏡下拍照，細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的紅色熒光，細(xì)胞生長情況良好，見圖1。

圖1 miRNA-125a-5p過表達(dá)、低表達(dá)慢病毒

2.2miRNA-125a-5p在PANC-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中的表達(dá) 與對(duì)照組對(duì)比，miRNA-125a-5p過表達(dá)組miRNA-125a-5p mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，miRNA-125a-5p低表達(dá)組miRNA-125a-5p mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，見圖2。

2.3胰腺癌皮下移植瘤Caspase-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量 與對(duì)照組對(duì)比，miRNA-125a-5p過表達(dá)組Caspase-8 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，miRNA-125a-5p低表達(dá)組Caspase-8 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見圖3。

2.4Western Blot 檢測(cè)Caspase-8在胰腺癌皮下移植瘤中的表達(dá) 凋亡相關(guān)因子Caspase-8在胰腺癌皮下移植瘤中的表達(dá)如圖4所示。與對(duì)照組對(duì)比，miRNA-125a-5p過表達(dá)組Caspase-8蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，miRNA-125a-5p低表達(dá)組Caspase-8 蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與對(duì)照組對(duì)比，*為P<0.01，△為P<0.05。

與對(duì)照組對(duì)比，*為P<0.01。

與對(duì)照組比較，△為P<0.05，*為P<0.01。

3 討論

胰腺癌在臨床上以惡性程度高、預(yù)后差為主要特點(diǎn)，目前胰腺癌的相關(guān)分子機(jī)制仍未完全明確。多項(xiàng)研究指出，細(xì)胞凋亡在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞凋亡是一種由基因編碼的程序性細(xì)胞死亡，也是維持組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，它破壞了細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的平衡，被廣泛認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[10]。Caspases為含有半胱氨酸殘基的一類蛋白酶，是凋亡細(xì)胞死亡的主要介質(zhì)，以酶原形式存在胞質(zhì)中，按照?qǐng)?zhí)行功能分為始動(dòng)因子、效應(yīng)子及炎癥介導(dǎo)因子，凋亡始動(dòng)因子被凋亡信號(hào)激活后引發(fā)凋亡系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，死亡受體(腫瘤壞死因子)與其環(huán)羧酸配體連接刺激受體聚集，其中死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)與procaspase-8結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)，最終引起Caspase-8酶原的激活，完成了細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)[11-13]。因此，Caspase-8作為細(xì)胞死亡信號(hào)誘導(dǎo)復(fù)合體中不可或缺的一員，參與細(xì)胞凋亡的主要過程。有研究證實(shí)，在胰腺癌中Caspase-8表達(dá)水平的改變可以導(dǎo)致效應(yīng)Caspase-3的激活失調(diào)，最終干擾癌細(xì)胞凋亡[14]；Carmona S等[15]證實(shí)，NV669主要通過激活Caspase-8來誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡；吳茱萸堿可激活Caspase-8，并活化其下游的Caspase-3，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡[16]。因此，凋亡相關(guān)因子Caspase-8 的激活在胰腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究則是通過檢測(cè)Caspase-8的表達(dá)水平，從而來驗(yàn)證細(xì)胞凋亡的情況。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125a-5p通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡，在腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。miRNA-125a-5p在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下降，可能通過靶向TP53促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，因此，miRNA-125a-5p可能是治療肝癌的一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)[17]；miRNA-125a-5p也可以通過靶向EGFR-TKI介導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性，提高肺癌患者的治療效果[18]；也有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，過表達(dá)miRNA-125a-5p可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miRNA-125a-5p可能是治療肝癌患者的潛在靶點(diǎn)。目前miRNA-125a-5p在胰腺癌中是否起到促進(jìn)凋亡的作用尚不清楚，為明確miRNA-125a-5p能否調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡，本研究篩選出miRNA-125a-5p過表達(dá)及低表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建胰腺癌皮下移植瘤模型，通過檢測(cè)Caspase-8的表達(dá)水平，對(duì)細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Caspase-8在miRNA-125a-5p過表達(dá)組中表達(dá)量升高，相反的，在miRNA-125a-5p低表達(dá)組中表達(dá)量降低。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示，miRNA-125a-5p在胰腺癌皮下移植瘤中促進(jìn)Caspase-8表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用。這表明了miRNA-125a-5p可能是胰腺癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，過表達(dá)miRNA-125a-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，從而提高胰腺癌患者的療效。但miRNA-125a-5p促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制有待未來進(jìn)一步研究探討。