吳妍，李會(huì)婷，張哲弢，史天陸

[中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，合肥 230001]

1 材料

1.1儀器 LC-2010A HT島津高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，四元低壓泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，LabSolutions Version 5.51色譜工作站)；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；L2-6K臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；FA2004B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司，感量：0.000 1 g)；XH-C渦旋混合器(金壇區(qū)白塔新寶儀器廠)；氮吹儀(上海皓莊儀器有限公司，型號(hào)：PBC-B2)；移液器(規(guī)格：10，100及1000 μL，DRAGONLAB)。

1.2試劑 CBZ對(duì)照品(CAS#：100142-201105，批號(hào)：8RBB-6M7R，規(guī)格：100 mg，含量：99.7%)、奧硝唑?qū)φ掌?ID：4QRY-WNB1，批號(hào)：100608-201102，規(guī)格：100 mg，含量：99.8%)以上均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；三乙胺(批號(hào)：20130918，規(guī)格：500 mL，純度：分析純)、二氯甲烷(批號(hào)：20160822，規(guī)格：500 mL，純度：分析純)，以上均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；磷酸二氫鉀(批號(hào)：180515，規(guī)格：500 g，純度：分析純，無錫市展望化工試劑有限公司)；滅菌注射用水(批號(hào)：2004213201，規(guī)格：500 mL，石家莊四藥有限公司)；色譜甲醇(批號(hào)：180702，規(guī)格：500 mL，純度：色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司)；醫(yī)用高純度氮?dú)?N2)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室工作實(shí)際，最終確定如下色譜條件，色譜柱：依利特Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇：0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液=40：60，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：20 μL。

2.2CBZ、奧硝唑工作液配制 精密稱取CBZ對(duì)照品5.0 mg至1.5 mL一次性離心管中，加1 mL色譜甲醇溶解得5 mg·mL-1CBZ儲(chǔ)備液。取適量色譜甲醇，依次將儲(chǔ)備液稀釋為5，10，20，40，80，100及160 μg·mL-1的系列濃度 CBZ工作液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。 另外精密稱取奧硝唑?qū)φ掌?.0 mg至1.5 mL一次性離心管中，加1 mL色譜甲醇溶解得5 mg·mL-1奧硝唑儲(chǔ)備液。取適量色譜甲醇，將儲(chǔ)備液稀釋為1 mg·mL-1奧硝唑工作液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

2.3自制CBZ血漿質(zhì)控品 取健康人血漿90 μL，分別加入5，10，20，40，80，100及160 μg·mL-1的CBZ工作液10 μL，得新鮮配制的自制CBZ血漿質(zhì)控品，濃度分別為0.5，1，2，4，8，10及16 μg·mL-1。

2.4即刻法室內(nèi)質(zhì)量控制

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“2.3”項(xiàng)下系列濃度質(zhì)控品分別加奧硝唑工作液5 μL，振蕩30 s后加二氯甲烷1 mL，渦旋操作3 min，劇烈振蕩約200次，5000 r·min-1離心5 min(r=6 cm)，取下層澄清液于另一一次性離心管，50 ℃氮?dú)?N2)吹干，經(jīng)甲醇100 μL溶解殘?jiān)?，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心5 min(r=6 cm)，取上清液60 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。待測(cè)質(zhì)控品標(biāo)示濃度(X， μg·mL-1)作為橫坐標(biāo)，CBZ與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=0.077 7X-0.002 1(r=0.999 4)。該結(jié)果表明，CBZ血藥濃度檢測(cè)線性范圍為0.5～16 μg·mL-1。典型色譜圖見圖1。

1.奧硝唑；2.卡馬西平。圖1 CBZ質(zhì)控品HPLC色譜圖1.ornidazole；2.carbamazepine.Fig.1 HPLC chromatogram of carbamazepine quality control product

2.4.2精密度及提取回收率試驗(yàn) 取新鮮配制高(10 μg·mL-1)、中(4 μg·mL-1)及低(1 μg·mL-1)濃度自制CBZ質(zhì)控品，經(jīng)“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)行血樣預(yù)處理后，吸取上清液60 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。重復(fù)該步驟平行操作6次，計(jì)算得高、中及低濃度CBZ質(zhì)控品日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)分別為2.47%，3.21%，6.34%。連續(xù)操作3 d，計(jì)算得日間精密度RSD分別為2.07%，5.35%，7.55%。與此同時(shí)，配制對(duì)應(yīng)高、中及低濃度不含生物基質(zhì)的CBZ對(duì)照品溶液(甲醇溶解)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。將質(zhì)控品測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較。每天平行操作6次，計(jì)算得CBZ高、中及低濃度質(zhì)控品日內(nèi)提取回收率分別為(72.18±3.01)%，(75.58±4.98)%及(65.15±2.18)%。連續(xù)操作3 d，計(jì)算得日間提取回收率分別為(73.73±7.24)%，(75.69±3.36)%及(69.76±5.17)%。具體見表1。試驗(yàn)結(jié)果符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)要求[12]。

表1 CBZ質(zhì)控品血藥濃度監(jiān)測(cè)的精密度及提取回收率 Tab.1 Precision and extraction recovery rate of carbamazepine quality control produt's concentration

表2 即刻法SI界值Tab.2 Seperation index community of instant method

表3 CBZ治療藥物監(jiān)測(cè)的即刻法室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù) Tab.3 Internal quality control data of instant method for therapeutic drug monitoring of carbamazepine

圖2 CBZ治療藥物監(jiān)測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控圖Fig.2 Internal quality control chart for therapeutic drug monitoring of carbamazepine

2.5CBZ治療藥物監(jiān)測(cè)的藥學(xué)實(shí)踐

2.5.1患者基本信息 患者，男，70歲。2019年5月15日因“發(fā)作性四肢抽搐2 h”就診我院神經(jīng)內(nèi)科，入院診斷為“癥狀性癲癇、多發(fā)性腦梗死、高血壓病3期、2型糖尿病”。

2.5.2診療過程 2019年5月15日醫(yī)囑給予CBZ 0.2 g，bid，長(zhǎng)期抗癲癇治療，住院期間癲癇未再發(fā)作；2019年5月21日監(jiān)測(cè)CBZ穩(wěn)態(tài)谷濃度5.05 μg·mL-1(隨行質(zhì)控品實(shí)測(cè)值為3.64 μg·mL-1，該點(diǎn)為即刻法室內(nèi)質(zhì)控的第一個(gè)點(diǎn)，即N=1)，癥狀好轉(zhuǎn)后出院。

2019年12月31患者因“發(fā)作性四肢抽搐4 h”再次入院，家屬代訴出院后遵醫(yī)囑長(zhǎng)期規(guī)律服用CBZ 0.2 g，bid，次日早晨監(jiān)測(cè)卡馬西平穩(wěn)態(tài)谷濃度為6.22 μg·mL-1(隨行質(zhì)控品實(shí)測(cè)值為3.39 μg·mL-1，N=8，N2s=2.03，計(jì)算即刻法SI上限=1.13，SI下限=1.48)，臨床醫(yī)師考慮CBZ單藥抗癲癇效果不佳，2020年1月1日醫(yī)囑卡馬西平0.2 g，bid，聯(lián)合拉莫三嗪25 mg，bid，抗癲癇，癥狀好轉(zhuǎn)后出院。

2020年4月5日患者再次因“發(fā)作性四肢抽搐4 d”入院，家屬代訴出院后遵醫(yī)囑長(zhǎng)期規(guī)律服用CBZ 0.2 g，bid，聯(lián)合拉莫三嗪25 mg，bid。病程中患者癲癇反復(fù)發(fā)作，尚有胡言亂語、精神障礙，高級(jí)皮層功能障礙，且有發(fā)熱?？紤]病情較重，立即完善頭顱磁共振、腦脊液檢查，排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染可能，予以苯巴比妥 0.1g，im，q8h控制癲癇癥狀；2020年4月6日早晨監(jiān)測(cè)CBZ 穩(wěn)態(tài)谷濃度4.79 μg·mL-1(隨行質(zhì)控品實(shí)測(cè)值為3.5 μg·mL-1，N=9，N2s=2.11，計(jì)算即刻法SI上限=1.38，SI下限=1.57)；2020年4月7日予以調(diào)整口服抗癲癇藥物方案為CBZ 0.2 g，tid，聯(lián)合拉莫三嗪100 mg，qd；2020年4月14日早晨監(jiān)測(cè)CBZ穩(wěn)態(tài)谷濃度3.35 μg·mL-1(隨行質(zhì)控品實(shí)測(cè)值為3.85 μg·mL-1，N=10，N2s=2.20，計(jì)算即刻法SI上限=1.26，SI下限=1.67)；住院期間患者癲癇癥狀逐步控制，逐漸減量苯巴比妥至2020年4月18日停用。2020年4月20日臨床醫(yī)師考慮患者病情平穩(wěn)，建議繼續(xù)維持CBZ 0.2 g，tid聯(lián)合拉莫三嗪100 mg，qd，口服抗癲癇藥物方案后出院。

2.5.3藥學(xué)實(shí)踐分析 基于TDM監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，2020年1月1日—2020年4年6日患者CBZ用量0.2 g，bid未調(diào)整，穩(wěn)態(tài)谷濃度卻下降至4.79 μg·mL-1；2020年4月7日—2020年4月14日患者CBZ用量由0.2 g，bid增加至0.2 g，tid，穩(wěn)態(tài)谷濃度仍持續(xù)下降，直至低于正常參考值下限，詳見圖3，但患者癲癇癥狀控制尚可，并未再次發(fā)作。臨床醫(yī)師希望藥師協(xié)助分析產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因。

圖3 CBZ血藥濃度變化趨勢(shì)圖Fig.3 Trend chart of carbamazepine plasma concentration

依據(jù)“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控評(píng)價(jià)理論，該患者4次CBZ血藥濃度監(jiān)測(cè)的隨行質(zhì)控品SI上限、SI下限均小于所對(duì)應(yīng)SI界值表的N2s，表明實(shí)測(cè)值結(jié)果在控，提示血藥濃度監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。藥師通過與患者家屬進(jìn)行溝通，排除了用藥依從性對(duì)血藥濃度造成的影響，分析導(dǎo)致患者CBZ穩(wěn)態(tài)谷濃度持續(xù)降低的可能因素：CBZ口服吸收完全，80%經(jīng)肝臟CYP3A4代謝為具有類似藥理作用的活性代謝產(chǎn)物10，11-環(huán)氧卡馬西平(carbamazepine epoxide，CBZ-E)[15-16]。CBZ與苯巴比妥均為CYP3A4誘導(dǎo)劑[15]。研究證實(shí)，卡馬西平可通過自身誘導(dǎo)作用，使其半衰期從35 h縮短為10～20 h[17]。有報(bào)道某患者長(zhǎng)期服用卡馬西平，最初測(cè)得CBZ穩(wěn)態(tài)血藥濃度為7.19 μg·mL-1，堅(jiān)持原方案服藥，4個(gè)月后復(fù)測(cè)CBZ穩(wěn)態(tài)血藥濃度僅2.53 μg·mL-1[18]。另外，苯巴比妥作為肝藥酶誘導(dǎo)劑，與CBZ聯(lián)用亦可加快其代謝，導(dǎo)致CBZ血藥濃度降低[19]。此外，拉莫三嗪作為一種新型廣譜抗癲癇藥物，其雖無明顯的肝藥酶誘導(dǎo)或抑制作用，但據(jù)報(bào)道難治性癲癇患者在接受原有抗癲癇方案治療至少3個(gè)月后，加用拉莫三嗪(平均日劑量200 mg)的所有患者CBZ-E穩(wěn)態(tài)濃度均較前明顯增加，平均增加約16%。與此同時(shí)，部分患者CBZ穩(wěn)態(tài)濃度較前降低約10%[20]。提示，拉莫三嗪與CBZ可能存在其他的潛在藥物相互作用，但確切機(jī)制尚未明確[20]。

患者出院后，藥師定期進(jìn)行隨訪，家屬代訴癲癇癥狀控制較好，2021年1月21日門診復(fù)查，未訴特殊不適，監(jiān)測(cè)CBZ穩(wěn)態(tài)谷濃度為7.69 μg·mL-1。由此可見，抗癲癇藥物的藥動(dòng)學(xué)特征非常復(fù)雜，多藥聯(lián)合使用時(shí)，開展抗癲癇藥物TDM，加強(qiáng)TDM的室內(nèi)質(zhì)控評(píng)價(jià)體系建設(shè)，可為臨床了解抗癲藥物以及合并用藥之間復(fù)雜的藥物相互作用提供大量有價(jià)值的信息。

3 討論

加強(qiáng)TDM的全面質(zhì)量控制對(duì)于確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性意義重大[21]。通常，室間質(zhì)評(píng)可用于反映實(shí)驗(yàn)室測(cè)定數(shù)據(jù)的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，衡量該實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制效果[22]。室內(nèi)質(zhì)控則有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程產(chǎn)生的誤差，確保了室間質(zhì)評(píng)調(diào)查成績(jī)穩(wěn)步提高[23]。2000年國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織專門針對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理制定了ISO/FDIS15189《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理》標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)調(diào)應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量體系。2001年我國(guó)也頒布了適合國(guó)情的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理辦法》，逐步對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)量控制實(shí)施全面管理。2019年《治療藥物監(jiān)測(cè)工作規(guī)范專家共識(shí)(2019版)》正式將室內(nèi)質(zhì)控納為TDM 質(zhì)量控制指標(biāo)之一[24]。但TDM室內(nèi)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[5]。

隨著分析檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，TDM技術(shù)也在不斷推陳出新[5]。目前，國(guó)內(nèi)外在用的CBZ血藥濃度檢測(cè)方法包括HPLC法[25]、CMIA法[26]、熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)法[27]以及靈敏度更高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[28]等。為確保不同TDM方法之間良好的相關(guān)性，促進(jìn)監(jiān)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)換，協(xié)助臨床醫(yī)師可參考不同TDM方法的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)制定最佳給藥方案。建立有效的TDM室內(nèi)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)方法顯得尤為重要。課題組前期基于Westgard多規(guī)則理論，通過繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖建立了拉莫三嗪治療藥物監(jiān)測(cè)的室內(nèi)質(zhì)量控制體系[10]。但是，筆者所在醫(yī)院用HPLC法監(jiān)測(cè)CBZ血藥濃度的樣本量較少，同批次質(zhì)控品短時(shí)間內(nèi)連續(xù)監(jiān)測(cè)20次難度較大。因此，不適宜采用Levey-Jennings質(zhì)控圖開展室內(nèi)質(zhì)控，“即刻法”優(yōu)點(diǎn)則在于同批號(hào)質(zhì)控品只要連續(xù)測(cè)定3次，即可對(duì)第3次及以后的數(shù)據(jù)進(jìn)行在控與失控狀態(tài)評(píng)價(jià)[4]。故本研究探索性使用“即刻法”進(jìn)行CBZ治療藥物監(jiān)測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控并開展藥學(xué)實(shí)踐。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前將室內(nèi)質(zhì)控評(píng)價(jià)理論應(yīng)用于TDM的藥學(xué)服務(wù)實(shí)踐報(bào)道較少。諶介秀等[29]首次將質(zhì)控圖聯(lián)合Westgard多規(guī)則法應(yīng)用于1例腎移植術(shù)后長(zhǎng)期接受他克莫司抗排斥治療特殊案例，分析了造成兩家醫(yī)療機(jī)構(gòu)測(cè)定同一血漿樣品他克莫司血藥濃度測(cè)定結(jié)果不一致的原因，減少了他克莫司治療藥物監(jiān)測(cè)的誤差，提高了醫(yī)師和患者對(duì)TDM結(jié)果的信任度。本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室CBZ隨行質(zhì)控品監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，基于1例癥狀性癲癇患者HPLC法CBZ血藥濃度值波動(dòng)的案例，應(yīng)用“即刻法”進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)，有效保證了監(jiān)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性。

當(dāng)然，采用“即刻法”進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控也存在一定的缺陷，即“遲后異常值”現(xiàn)象[3]。表現(xiàn)為在測(cè)定次數(shù)相對(duì)較少時(shí)，有些失控的離群值不會(huì)顯示為警告點(diǎn)，但隨著測(cè)定次數(shù)的增加，測(cè)定值逐漸趨于穩(wěn)定后，以前未顯示的離群值將會(huì)暴露出來，顯示為警告甚至失控的狀態(tài)。因此，應(yīng)結(jié)合“即刻法”室內(nèi)質(zhì)控圖及時(shí)觀察質(zhì)控曲線的趨勢(shì)性變化，考慮諸多主、客觀因素可能造成的影響，做好日常工作中質(zhì)量控制培訓(xùn)，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化操作流程?？傊?，課題組結(jié)合所在實(shí)驗(yàn)室HPLC法CBZ治療藥物監(jiān)測(cè)的送檢樣本量情況，量體裁衣，制定了“即刻法”室內(nèi)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)體系，具有較強(qiáng)的臨床適用價(jià)值，建議針對(duì)臨床必需、但監(jiān)測(cè)頻次相對(duì)較低的血藥濃度監(jiān)測(cè)項(xiàng)目推廣應(yīng)用。