張春雷，吳新玉，王棟，陸倩，董莉，張金娟，廖尚高

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴安新區(qū) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴安新區(qū) 550025)

肝纖維化是指由化學(xué)毒物性損傷、慢性肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒等因素引起的以肝內(nèi)結(jié)締組織非正常增生為主要特征的病理生理過(guò)程[1]。中藥治療肝纖維化具有療效高、低毒副反應(yīng)、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸得到人們的重視[2]。TGF-β1/Smad信號(hào)通路在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用，調(diào)控層粘連蛋白(laminin，LN)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)及羥脯氨酸等蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[3]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是肝纖維化活化的標(biāo)志物，Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I)主要反映肝纖維化程度[4]。大王馬先蒿(PedicularisrexC.B.，PR)為玄參科(Scrophulariaceae)馬先蒿屬(Pedicularis)植物，臨床上用于慢性肝炎、肝硬化腹水等癥的治療[5-6]，現(xiàn)代研究表明，大王馬先蒿的化學(xué)成分主要為苯丙素、環(huán)烯醚萜、黃酮等[7]。基于肝纖維化是肝硬化的早期階段，筆者推測(cè)對(duì)肝硬化或肝硬化腹腔積液有療效的藥物可能對(duì)肝纖維化有效。因此，本研究擬進(jìn)一步通過(guò)建立四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，探討大王馬先蒿對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化體內(nèi)作用，為大王馬先蒿抗肝纖維化的臨床應(yīng)用及相關(guān)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠，60只，雄性，體質(zhì)量(20±2) g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(黔)2018-0001；自由飲水，光照12 h/黑暗12 h，溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于正式實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物和試劑 大王馬先蒿(PedicularisrexC.B.Clark，PR)全株，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院龍慶德副教授鑒定(批號(hào)：201910)。秋水仙堿(批號(hào)：S15A8C34051)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCl4(批號(hào)：L1602077)購(gòu)自阿拉丁工業(yè)公司，臨用前用橄欖油稀釋?zhuān)籘GF-β1(批號(hào)：ab179695)，α-SMA(批號(hào)：ab124964)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Smad3(批號(hào)：L1602077)，Collagen I(批號(hào)：10423R)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，GAPDH(批號(hào)：T0004)購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)分別為20200109，20200110)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(HA)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA Kits)(批號(hào)：B16011450)，層粘蛋白(LN)酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA Kits)(批號(hào)：A22011449)購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，PC-Ⅲ ELISA Kits (批號(hào)：L210104920)，IV-C ELISA Kits (批號(hào)：L210104913)購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；4%多聚甲醛組織固定液(批號(hào)：69111800)購(gòu)自Biosharp 公司。

1.3儀器 全波段多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Tek 公司，型號(hào)：ELX800)；移液器(德國(guó) Eppendorf 股份公司，型號(hào)：P13199E)； XH-B 型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；K30 型干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；CP124C 型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司，感量：0.1 mg]；Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó) Eppendorf 公司)；HK-UP-20 分析型超純水機(jī)(合肥宏科科技有限公司)；SIM-F140AY65 雪花制冰機(jī)(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)。

1.4藥材提取 大王馬先蒿樣品制備：稱(chēng)取大王馬先蒿2 kg，第1次加95%乙醇提取2 h濾過(guò)，第2次加95%乙醇提取1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至浸膏備用。

1.5造模、分組及給藥[8]將60只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組[9]及大王馬先蒿小、中、大劑量組，每組10只；大王馬先蒿組給藥劑量設(shè)置依據(jù)該藥臨床劑量(每天15～30 g)[10]，選擇每天26 g的臨床劑量換算成小鼠等效劑量小劑量[200 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]，再依次得出中劑量[400 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]與大劑量[800 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠按照文獻(xiàn)[11]方法均腹腔注射經(jīng)橄欖油稀釋的CCl4溶液(1 mL·kg-1)造模，每周2次，連續(xù)12周，正常對(duì)照組腹腔注射等體積橄欖油；實(shí)驗(yàn)第5周，秋水仙堿組灌胃0.1 mg·kg-1秋水仙堿，大王馬先蒿小、中、大劑量組分別灌胃200，400，800 mg·kg-1大王馬先蒿提取物，正常對(duì)照組和肝纖維化模型對(duì)照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉；每天1次，持續(xù)至第12周結(jié)束，期間密切觀察小鼠外表，活動(dòng)狀態(tài)。

1.6血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平檢測(cè) 末次給藥1 h后，使用水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，待室溫沉降2 h后，3000 r·min-1離心15 min(r=5 cm)，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作方法，檢測(cè)大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠血清AST、ALT、HA、LN、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平的影響。

1.7肝組織TGF-β1，Smad3，α-SMA及Collagen I表達(dá)檢測(cè) 小鼠取血后迅速在冰盤(pán)上取出肝組織，稱(chēng)取固定部位的肝組織100 mg，經(jīng)預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰水浴中進(jìn)行裂解(20 min)，然后離心(10 000 r·min-1，15 min，r=5 cm)[12]；二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白(10 μg)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入TGF-β1(1：1000)，Smad 3(1：1000)，α-SMA(1：1500)及Collagen I(1：500)一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜后室溫孵育1 h；經(jīng)緩沖液TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)，繼續(xù)室溫孵育1 h后，TBST洗膜(10 min×3次)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。采用圖像分析軟件分析各條帶吸光度值，通過(guò)目的條帶吸光度與內(nèi)參(GAPDH)吸光度的比值進(jìn)行半定量分析。

1.8蘇木精-伊紅(HE)，馬松(Masson)染色 實(shí)驗(yàn)時(shí)取肝組織放入4%多聚甲醛中，后經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋等步驟后，行連續(xù)切片后封閉。常規(guī)方法進(jìn)行HE和Masson染色，鏡下觀察肝組織病理形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠一般狀態(tài)的影響 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各組小鼠精神狀態(tài)好，活動(dòng)能力強(qiáng)，毛色白，有光澤。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，由CCl4誘導(dǎo)的模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)形體消瘦，皮毛豎立，欠光澤，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲緩，攝食量減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常對(duì)照組毛色光澤，飲食如常，活潑好動(dòng)；模型對(duì)照組小鼠明顯出現(xiàn)食欲減退，形體瘦弱，體質(zhì)量減輕，豎毛，毛色略暗，反應(yīng)略顯遲緩，呈現(xiàn)疾病狀態(tài)；秋水仙堿組、大王馬先蒿小、中、大劑量組小鼠，活動(dòng)頻率如常，攝食一般。取肝臟組織后觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組肝臟表面光滑，透亮，無(wú)異常；模型對(duì)照組肝臟與周?chē)M織粘連明顯，邊緣圓頓，質(zhì)地硬，肝臟表面呈彌漫的細(xì)小結(jié)節(jié)伴有淡黃色腹水；大王馬先蒿小、中、大劑量組和秋水仙堿組的情況對(duì)比模型對(duì)照組有所減輕。

2.2大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠肝臟和脾臟指數(shù)的影響 通過(guò)稱(chēng)量小鼠的體質(zhì)量、肝臟和脾臟的質(zhì)量，按照公式：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)采用肝臟指數(shù)，脾臟指數(shù)進(jìn)行比較。肝臟受到損傷越重肝臟指數(shù)越高。和正常對(duì)照組小鼠肝指數(shù)和脾指數(shù)比較，模型對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。秋水仙堿組和大王馬先蒿小、中、大劑量組小鼠的肝指數(shù)和脾指數(shù)相比模型對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。秋水仙堿組與大王馬先蒿各劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠臟器指數(shù)的影響 Tab.1 Effect of Pedicularis rex on organ index in liver fibrosis mice

2.3大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平的影響 與正常對(duì)照組比較，肝纖維化模型對(duì)照組小鼠血清 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST及ALT 水平升高 (P<0.01)，提示造模成功；與肝纖維化模型對(duì)照組小鼠比較，小、中、大劑量大王馬先蒿組與秋水仙堿組小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST、ALT水平均降低 (P<0.01)，大王馬先蒿大劑量組血清HA水平與藥秋水仙堿組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余各組無(wú)明顯差異。見(jiàn)表 2。

表2 大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平的影響 Tab.2 Effect of Pedicularisrex on serum HA, LN, PCⅢ, Ⅳ-C, ALT and AST levels in liver fibrosis mice

2.4大王馬先蒿對(duì)CCl4性肝纖維化小鼠肝臟病理變化的影響 采用HE和Masson染色進(jìn)行觀察，正常對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉完整，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)僅有少量的纖維組織。肝纖維化模型對(duì)照組小鼠部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，有脂肪空泡、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并有假小葉形成，肝細(xì)胞普遍壞死，膠原纖維大量增生并形成纖維間隔。秋水仙堿組肝纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞索排列基本整齊，見(jiàn)少量的纖維間隔形成，肝細(xì)胞壞死減少，脂肪空泡減少，炎癥減輕，在匯管區(qū)觀察少量纖維組織增生。大王馬先蒿小、中、大劑量組與模型對(duì)照組相比，肝纖維化的現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，匯管區(qū)膠原纖維增生減少，纖維間隔變窄，肝細(xì)胞壞死程度減輕，脂肪空泡減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖1，2。

2.5大王馬先蒿對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，α-SMA及Collagen I表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，肝纖維化模型對(duì)照組小鼠肝組織 TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I表達(dá)增加 (P<0.01)；與肝纖維化模型對(duì)照組小鼠比較，小、中、大劑量的大王馬先蒿組小鼠肝組織TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I蛋白表達(dá)均降低 (P<0.01)，大王馬先蒿大劑量組與秋水仙堿組比較，Smad3及α-SMA表達(dá)水平較秋水仙堿組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表3。

表3 大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1，Smad3，α-SMA及Collagen I表達(dá)的影響 Tab.3 Effect of Pedicularisrex on the expressions of TGF-β1, Smad3, α-SMA and collagen I in liver tissue of liver fibrosis mice

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.秋水仙堿組；D.大王馬先蒿小劑量組；E.大王馬先蒿中劑量組；F.大王馬先蒿大劑量組。圖1 大王馬先蒿對(duì)肝纖維化小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響(HE，×200)A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.Pedicularis rex low-dose group；E.Pedicularis rex medium-dose group；F.Pedicularis rex high-dose group.Fig.1 Effect of Pedicularis rex on liver histopathology in liver fibrosis mice(HE，×200)

圖3 Western blotting檢測(cè)各組 TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of TGF-β1, Smad3, α-SMA and collagen I proteins detected by Western blotting

3 討論

肝纖維化是肝臟受到各種慢性炎癥損傷時(shí)，肝細(xì)胞外基質(zhì)異常分泌并沉積的可逆性創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。腹腔注射CCl4出現(xiàn)肝損傷或壞死，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。通過(guò)CCl4誘導(dǎo)建立的肝纖維化動(dòng)物模型，其肝組織在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等方面與人類(lèi)肝纖維化相似。因此，用CCl4誘導(dǎo)動(dòng)物肝纖維化模型，已被廣泛應(yīng)用于防治肝纖維化藥物篩選及其作用機(jī)制的研究[13]。當(dāng)肝功能受損時(shí)，可引起肝細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ALT、AST滲出進(jìn)入血液，使其血液濃度明顯增加[14]，AST和ALT是肝功能損傷最敏感的指標(biāo)。另一方面，由于HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C參與ECM合成，是肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞的重要因素，肝纖維化過(guò)程常伴有肝細(xì)胞受損和HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平明顯升高，檢測(cè)血清中這4種指標(biāo)可準(zhǔn)確、靈敏地反映肝內(nèi)纖維生成的情況，是臨床診斷肝纖維化的敏感指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大王馬先蒿可以有效降低肝纖維化模型小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST和ALT水平，表明大王馬先蒿具有保護(hù)肝臟免受損傷，降低肝纖維化的作用。另外，肝組織病理變化也說(shuō)明大王馬先蒿給藥組減少了CCl4引起的膠原纖維增生和肝細(xì)胞變性，減少了肝臟切片中炎性細(xì)胞分布。另外，與CCl4誘導(dǎo)的模型對(duì)照組相比，大王馬先蒿給藥組還可降低小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)，減輕臟器的腫脹及脂質(zhì)化程度。以上結(jié)果都表明大王馬先蒿對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠具有較好的保護(hù)作用。

TGF-β1通過(guò)激活肝星狀細(xì)胞(HSC)和成纖維細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，是肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵介質(zhì)[16]。而Smad蛋白可將TGF-β1信號(hào)由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)控LN、HA及羥脯氨酸等蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[17-18]。此外，α-SMA被認(rèn)為是肝纖維化標(biāo)志物、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白反映了肝纖維化程度，并參與一系列炎癥和纖維化的過(guò)程[19]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃給予肝纖維化模型小鼠小、中、大劑量大王馬先蒿后，模型小鼠肝組織TGF-β1、Smad 3、α-SMA及Collagen I蛋白表達(dá)水平明顯降低。這些結(jié)果表明，大王馬先蒿對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的保護(hù)作用可能與抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路，進(jìn)而阻止肝星狀細(xì)胞活化，下調(diào)α-SMA和Collagen I蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，大王馬先蒿對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠具有較好的保護(hù)作用，該作用與抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路及下調(diào)α-SMA和Collagen I蛋白表達(dá)有關(guān)。