趙子璇，郭新燕，馮振博

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院病理科，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)昭平縣人民醫(yī)院病理科，昭平 546800）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤，在中國地區(qū)高發(fā)[1]。迄今為止，HCC患者可以采用的治療策略包含外科手術(shù)、射頻消融、肝動(dòng)脈化學(xué)栓塞和免疫治療等，由于HCC 發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，上述治療手段對(duì)部分HCC患者收效甚微，以至于其5 年生存率僅為12%至15%[2]。改善術(shù)后高復(fù)發(fā)率，提高放化療敏感性以及如何對(duì)HCC 患者做出早期診斷等仍是目前HCC 研究領(lǐng)域的重點(diǎn)?；谝陨蠁栴}，深入研究HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制，有助于尋求新的診斷和治療策略以改善HCC患者的總體預(yù)后。

CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）轉(zhuǎn)錄因子家族參與多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、分化、代謝和免疫反應(yīng)。這個(gè)家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員被命名為CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α 基因（CCAAT/enhancer binding proteinα，CEBPA）[3]。CEBPA 是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在正常生理過程和疾病發(fā)生中起正、負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在肝、肺、外周血單核細(xì)胞和胎盤中高度表達(dá)[4]。CEBPA 通常作為腫瘤抑制因子，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡和代謝。在幾種類型的癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了CEBPA 的低表達(dá)[5]。最近的研究表明，CEBPA廣泛參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，包括胃癌、乳腺癌、肝癌和膀胱癌[6-9]。CEBPA 在多種惡性腫瘤中具有潛在的臨床價(jià)值。本研究是首次結(jié)合癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）等數(shù)據(jù)庫的樣本進(jìn)行全面分析，初步驗(yàn)證CEBPA mRNA在HCC中的表達(dá)，隨后采用RT-qPCR 驗(yàn)證CEBPA 在HCC 細(xì)胞系Huh7 中mRNA 的表達(dá)，并通過免疫組化技術(shù)驗(yàn)證CEBPA蛋白水平的表達(dá)及其與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 基于mRNA和芯片數(shù)據(jù)的獲取與分析

整合TCGA和GTEx中肝細(xì)胞癌和鄰近非癌組織的mRNA 數(shù)據(jù)集，包括371 例肝細(xì)胞癌和225 例非癌對(duì)照的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。隨后，于GEO中檢索肝細(xì)胞癌相關(guān)高通量數(shù)據(jù)，收集9 個(gè)平臺(tái)中與肝細(xì)胞癌相關(guān)的67 個(gè)mRNA 芯片，包括3 356 例癌樣本和2 979 例非癌樣本。使用R 語言和Perl 語言對(duì)不同平臺(tái)合并，并且去除平臺(tái)間批次效應(yīng)。所有數(shù)據(jù)處理前，對(duì)原始表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2處理。

1.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

選擇一種肝細(xì)胞癌細(xì)胞系（Huh7）和一種正常人肝細(xì)胞（L02）進(jìn)行總RNA的提取。其中，總RNA采用Mini BEST Universal RNA extraction KIT（Ta-KaRa）純化，cDNA 采用Prime-Script RT Master Mix（TaKaRa）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成。在7500 系統(tǒng)中進(jìn)行RT-qPCR。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的樣本進(jìn)行分析一式3份。本研究使用的引物序列如下：CEBPA-F 5'-GTGGCAGGAGGAGGGCTCAG-3'；CEBPA-R 5'-TTCTAAGACAGGCGTGGAGGAG-3'。

1.3 免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemical，IHC）

1.3.1 標(biāo)本收集 收集2020年9月至2021年3月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理科確診為HCC患者的石蠟標(biāo)本，包括90例癌組織石蠟標(biāo)本及對(duì)應(yīng)癌旁組織石蠟標(biāo)本作為對(duì)照組，同時(shí)收集患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者；術(shù)前未接受放療、化療以及內(nèi)分泌治療等輔助治療的患者。

1.3.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)主要試劑和方法 兔抗人CEBPA多克隆抗體（購自abclonal抗體官方網(wǎng)站，貨號(hào)A0904，濃度1∶50）、通用二步法檢測試劑盒、EDTA 抗原修復(fù)液、DAB 顯色試劑盒。將組織石蠟塊按照切片、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、抗原抗體反應(yīng)、顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片的步驟，采用免疫組化EnVision法和DAB進(jìn)行顯色。

1.3.3 染色結(jié)果評(píng)估 在高倍鏡視野中記錄蛋白的表達(dá)。無顏色、淡黃色、棕褐色、深褐色分別代表0分、1分、2分、3分。染色細(xì)胞百分率分為0個(gè)染色點(diǎn)＜5%，1 個(gè)染色點(diǎn)為5%～24%，2 個(gè)染色點(diǎn)為25%～49%，3個(gè)染色點(diǎn)為50%～75%，4個(gè)染色點(diǎn)為＞75%。總分?jǐn)?shù)計(jì)為染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和染色點(diǎn)數(shù)的乘積，最高12 分。結(jié)果低表達(dá)為0～7 分，高表達(dá)為8～12分。

1.4 HCC中CEBPA上調(diào)的可能機(jī)制

使用Robust rank aggregation（RRA）結(jié)合人工ranking 的方式，篩選出CEBPA 相關(guān)基因。通過測序數(shù)據(jù)篩選出HCC 的差異表達(dá)基因（DEGs），在（http://cistrome.org/db/）下載CEBPA 預(yù)測的靶基因。如果CEBPA共表達(dá)基因、差異基因和靶基因也在HCC 的癌變過程中發(fā)揮作用，那么它們與CEBPA的協(xié)同或拮抗作用對(duì)HCC的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響的可能性更大。因此，取CEBPA 相關(guān)基因、靶基因與HCC 測序的DEGs 的交集，篩選出交叉基因，使用R 包c(diǎn)lusterProfiler 將交叉基因進(jìn)行g(shù)ene ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes Genomes（KEGG）分析，并繪制氣泡圖將富集分析可視化。使用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析，將KEGG 通路分析中主要通路的基因輸入網(wǎng)站中，通過蛋白—蛋白相互作用（PPI）分析，構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)，直線表示蛋白質(zhì)之間的相互作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。在隨機(jī)效應(yīng)模型中，采用STATA 12.0生成綜合的總標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）和95%可信區(qū)間（CI）的森林圖和summary ROC（SROC）曲線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于數(shù)據(jù)庫的CEBPA mRNA表達(dá)的驗(yàn)證

GEO芯片數(shù)據(jù)與TCGA序列數(shù)據(jù)合并進(jìn)行meta 分析，結(jié)果表明：CEBPA 在HCC 組織中的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織（SMD=0.51；95%CI：0.14～0.87；I2=95.8%）（圖1B）；集成SROC曲線下面積（AUC）為0.79（95%CI：0.75～0.82）（圖1A）。CEBPA 的合并的敏感性為0.66（圖2A），合并的特異性為0.64（圖2B），合并的陽性似然比（PLR）為2.05（圖2C），合并的陰性似然比（NLR）為0.42（圖2D）和合并的診斷優(yōu)勢比（DOR）為6.01（圖2E）。經(jīng)過全面綜合分析顯示，CEBPA 在HCC 中是高表達(dá)的。提示HCC中CEBPA mRNA的表達(dá)可能是一種很有前景的生物標(biāo)志物。

圖1 TCGA序列數(shù)據(jù)和GEO芯片數(shù)據(jù)綜合分析結(jié)果

圖2 集成所有數(shù)據(jù)集的診斷價(jià)值

2.2 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果

檢測HCC細(xì)胞系Huh7及正常肝細(xì)胞系L02中CEBPA的表達(dá)。內(nèi)參及CEBPA在擴(kuò)增過程中均無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。根據(jù)CT 值計(jì)算出Huh7 與L02 的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示：CEBPA 在HCC細(xì)胞系Huh7中的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞系L02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

圖3 CEBPA 在HCC 細(xì)胞系HuH7 和正常肝細(xì)胞系L02 中的表達(dá)（P＜0.01）。

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 CEBPA 蛋白在HCC 組織及癌旁肝組織中的表達(dá)

在HCC 組織中，CEBPA 蛋白定位于細(xì)胞核。CEBPA 蛋白分別在癌組織及癌旁組織中陽性表達(dá)及陰性表達(dá)的情況（圖4）。在肝細(xì)胞癌組織中，67例高表達(dá)（74.4%），23 例低表達(dá)（25.6%）；在癌旁肝組織中，僅37 例CEBPA 蛋白高表達(dá)（41.1%），53 例CEBPA 蛋白低表達(dá)（58.9%）。結(jié)果表明，相對(duì)于癌旁肝組織，CEBPA 蛋白在HCC 組織中顯著高表達(dá)（P＜0.01），見表1。

表1 CEBPA蛋白在肝細(xì)胞癌組織及癌旁肝組織中的表達(dá) n（%）

圖4 免疫組化染色結(jié)果（EnVision 法和DAB進(jìn)行顯色（A、D、G、J 為×100；B、E、H、K為×200；C、F、I、L為×400）

2.3.2 CEBPA 蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

HCC 患者的臨床病理參數(shù)包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、肝炎病史情況、肝硬化情況、血AFP 值、病理觀察微血管侵犯情況及衛(wèi)星結(jié)節(jié)形成。評(píng)估90 例患者切片的免疫組化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CEBPA蛋白的差異表達(dá)在患者病理分級(jí)（P=0.024）及TNM分期中的T分期（P=0.023）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 CEBPA 蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3.3 CEBPA在HCC中的潛在功能和途徑

使用R篩選出每個(gè)數(shù)據(jù)集的4 535個(gè)CEBPA共基因。通過測序數(shù)據(jù)篩選出至少出現(xiàn)9次的差異基因。在Cistrome網(wǎng)站中篩選CEBPA的靶基因，將共表達(dá)基因、差異基因和靶基因取交集得到277 個(gè)交叉基因進(jìn)行GO和KEGG分析。交叉基因主要集中在染色體區(qū)域（圖5A）；核分裂是最主要的生物學(xué)過程（圖5B），與蛋白質(zhì)C-末端結(jié)合等分子功能有關(guān)（圖5C）。KEGG結(jié)果表明，交叉基因主要集中在細(xì)胞周期信號(hào)通路中（圖5D）?？紤]到蛋白質(zhì)很少單獨(dú)發(fā)揮作用，用富集在該通路的基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示CDC20 在CEBPA 靶標(biāo)中具有最高蛋白相互作用，可能為其靶基因（圖5E）。

圖5 相交基因GO富集分析、KEGG通路的氣泡圖及富集于細(xì)胞周期通路基因的PPI圖

3 討論

第1 個(gè)CEBP 蛋 白，即CEBPA 在Steve McKnight 的實(shí)驗(yàn)室中被鑒定為大鼠肝核中的熱穩(wěn)定因子[10]。CEBPA是1 個(gè)無內(nèi)含子基因，定位于染色體帶19q13.1，具有富含GC 的編碼區(qū)。它屬于堿性粘蛋白拉鏈（b-ZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族，由高度同源的C-末端DNA 結(jié)合（堿性區(qū)）和二聚化（亮氨酸拉鏈）基序以及兩個(gè)不太保守的N-末端反式激活域組成，其可以產(chǎn)生兩種不同的蛋白質(zhì)亞型，較長的42 ku 亞型，也稱為p42，以及較短的30 ku亞型或p30[11-12]。

本研究首次通過整合芯片和序列數(shù)據(jù)綜合分析研究了CEBPA 的差異表達(dá)，同時(shí)結(jié)合RT-qPCR、IHC 進(jìn)一步驗(yàn)證CEBPA 在HCC 中的表達(dá)情況。在本研究中，通過對(duì)芯片數(shù)據(jù)和序列數(shù)據(jù)中收集到3 727 例HCC 和3 204 例非癌樣本綜合分析可知，CEBPA 在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于非癌組織；RT-qPCR 結(jié)果顯示CEBPA 在HCC 細(xì)胞系Huh7中的表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞系L02，由于只檢測了1株HCC細(xì)胞系中CEBPA的表達(dá)，有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)收集90組肝細(xì)胞肝癌和癌旁組織樣本，通過IHC 進(jìn)行蛋白水平的檢測，證實(shí)了CEBPA 在HCC組織中表達(dá)比癌旁組織陽性率高，表明CEBPA在HCC 的鑒別中有一定的價(jià)值作用。IHC 結(jié)果顯示，CEBPA 蛋白主要定位在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，CEBPA 蛋白的差異表達(dá)在HCC 患者病理分級(jí)及TNM 分期中的T 分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，病理分期Ⅲ～Ⅳ級(jí)的患者組織中CEBPA 陽性表達(dá)率比Ⅰ～Ⅱ級(jí)高。推測CEBPA 可能是HCC的致癌因子，參與HCC的進(jìn)展和預(yù)后，具有一定的臨床意義，有望成為肝細(xì)胞癌治療的關(guān)鍵基因之一。通過對(duì)CEBPA的共表達(dá)基因、差異基因和靶基因取交集基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析，這些基因主要富集在細(xì)胞周期等通路。細(xì)胞周期的改變?cè)趲缀跛械陌┌Y類型中都很常見。CEBPA 通過其協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄輸出和細(xì)胞周期進(jìn)程的能力來控制分化[13]，在大部分癌，如在乳腺癌細(xì)胞系中恢復(fù)CEBPA 表達(dá)導(dǎo)致抑制與G0-G1 細(xì)胞周期停滯相關(guān)的生長[14]，在急性髓系白血病中p53-KLF4-CEBPA 調(diào)控軸導(dǎo)致細(xì)胞周期控制的喪失[15]。這些研究進(jìn)一步證明了CEBPA 參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，CEBPA 可能通過細(xì)胞周期通路促進(jìn)HCC的發(fā)展。

CEBPA參與正常生理過程和疾病發(fā)生發(fā)展，在胚胎發(fā)生過程中起著重要作用，CEBPA的表達(dá)是維持胚胎和成體組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)[16-19]。CEBPA在肝臟、脂肪組織、髓樣細(xì)胞、皮膚、肺、乳腺、小腸、胰腺、腎上腺、骨骼肌、結(jié)腸和前列腺等多種組織和細(xì)胞類型中均有表達(dá)，但其表達(dá)主要見于終末分化細(xì)胞[20]。在前列腺癌、B 細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病和肝母細(xì)胞瘤中，無突變的CEBPA蛋白上調(diào)并表現(xiàn)出致癌作用[21-23]。

能量代謝在HCC中具有重要意義，利用癌細(xì)胞代謝脆弱的特性尋找相關(guān)治療手段成為肝癌治療的一種策略，既往研究也證實(shí)，CEBPA 也參與HCC中能量代謝，然而，腫瘤的異質(zhì)性表現(xiàn)出不同的能量代謝需求為肝癌的治療帶來了挑戰(zhàn)。C/EBPα 不僅參與肝癌能量代謝，且與肝再生終止的調(diào)節(jié)和肝大小的調(diào)節(jié)相關(guān)，C/EBPα與C/EBP β相互作用表現(xiàn)出“肝穩(wěn)態(tài)”的復(fù)雜現(xiàn)象[24]。本文免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于癌旁肝組織，CEBPA蛋白在HCC組織中顯著高表達(dá)，既往有研究顯示，與HCC 組織微陣列中相鄰的非腫瘤肝組織相比，CEBPA蛋白的表達(dá)增加，這與本研究結(jié)果一致。C/EBPα 將HCC 致癌作用與自噬介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝和對(duì)能量饑餓的抵抗聯(lián)系起來，并且通過分析C/EBPα 在HCC 中的表達(dá)預(yù)測了患者的預(yù)后[8]。研究已經(jīng)確定實(shí)體瘤中C/EBPα 水平調(diào)控的多種機(jī)制，包括microRNA（miRNA）表達(dá)、缺氧和癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制。尋找C/EBPα上游調(diào)控信號(hào)通路，以尋找可用藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)是阻斷C/EBPα在肝癌細(xì)胞中表達(dá)并抑制依賴于其促癌作用的腫瘤生長的有效途徑，目前研究顯示，miR-182、miR-124、miR-25 等與C/EBPα 表達(dá)相關(guān)，可能為治療肝癌提供靶點(diǎn)[25-26]。

綜上所述，CEBPA在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)較高，可能參與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展，并作為一種潛在預(yù)測因子，為肝細(xì)胞肝癌的早期診斷提供新的思路。