黃仲辰，陳曉菊，姚意恩，李超乾△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2.附屬腫瘤醫(yī)院綜合內(nèi)科，南寧 530021）

哮喘的機制尚未完全闡明，本課題組前期研究證實，γδT細(xì)胞參與哮喘的致病過程并存在Th1/Th2細(xì)胞模式失衡[1]，證實霧化吸入滅活草分枝桿菌可以使哮喘體內(nèi)Th1/Th2 失衡得以糾正，從而使γδT細(xì)胞內(nèi)Th1/Th2 失衡也得以恢復(fù)[2-3]，進(jìn)而使肺部炎癥病變減輕[4]；也證實了哮喘小鼠中γδT 細(xì)胞Th17/Treg的失衡可能與卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘發(fā)哮喘的發(fā)病機制有關(guān)[5]。另外，本課題組前期實驗證明霧化吸入滅活草分枝桿菌可以減輕哮喘小鼠氣道炎癥，原理可能是上調(diào)T-bet mRNA表達(dá)而下調(diào)GATA-3 mRNA 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，最終Th2 細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子水平的作用受到抑制[6]。本研究旨在觀察過繼經(jīng)母牛分枝桿菌霧化免疫后的γδT 細(xì)胞對哮喘小鼠模型的干預(yù)作用，并進(jìn)一步探討母牛分枝桿菌對T-bet、GATA3 以及白介素（IL）-13、IL-5表達(dá)的影響，為臨床霧化吸入滅活分枝桿菌防治哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 OVA（美國sigma 公司）、氫氧化鋁凝膠、母牛分枝桿菌22.5 μg 注射液（安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司），小鼠IL-13、IL-5 ELISA 試劑盒。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀、超聲霧化器WH-2000、病理圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）、NanoDrop 2000超微量分光光度計5810R 高速低溫離心機，肺功能儀NAM 系統(tǒng)（美國DSI 公司），F(xiàn)ACS CantoⅡ型流式儀。

1.1.3 OVA 試劑配制 OVA 混懸液配制：取25 mg OVA 溶于高壓滅菌的10 mL PBS 溶液中，取100 μL到4 mL EP管中，再加入1 650 μL的PBS溶液，放置4 ℃冰箱保存，使用時每管加入250 μL 的氫氧化鋁凝膠，現(xiàn)配現(xiàn)用。每只小鼠使用25 μg OVA+1 mg氫氧化鋁凝膠，注射0.2 mL；OVA霧化激發(fā)溶液配制：OVA粉末溶于PBS溶液中，配制成2%濃度的溶液，放置4 ℃冰箱保存。

1.1.4 γδT細(xì)胞制取 40只SPF級雄性TCR-β-/-小鼠（該種小鼠沒有T 細(xì)胞，不會排斥同種異體移植物）購于北京百奧賽圖基因生物技術(shù)公司，6～8 周齡，體重（20±2）g。將這些小鼠隨機分為對照組和母牛分枝桿菌霧化組，每組20 只，兩組各置于霧化器內(nèi)并分別予生理鹽水、母牛分枝桿菌霧化。霧化時，母牛分枝桿菌組用10 mL生理鹽水稀釋1支注射用母牛分枝桿菌注射液（22.5 μg/mL），霧化30 min，每天1 次，連續(xù)霧化5 d；對照組予以10 mL 生理鹽水代替霧化。末次霧化后用10%水合氯醛麻醉小鼠，將小鼠左側(cè)臥位并固定好，剪開小鼠左上腹皮膚，取出脾臟，制備脾單細(xì)胞懸液，隨后用磁珠分選法分選γδT 細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞術(shù)檢測分選γδT 細(xì)胞的純度，如果純度大于80%，即可用于鼠尾靜脈注射。

1.2 動物分組與模型建立

32 只SPF 級健康雄性Balb/c 小鼠（該種小鼠常用于哮喘模型制作效果較好[7]），6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。將32 只SPF 級雄性Bal b/c 小鼠隨機分為4 組，對照組（A組）、哮喘模型組（B組）、TCR-β-/-小鼠經(jīng)生理鹽水霧化后提取的γδT細(xì)胞過繼組（C組）、TCR-β-/-小鼠經(jīng)母牛分枝桿菌霧化后提取γδT細(xì)胞過繼組（D組）。B 組、C 組和D 組用雞卵清蛋白（OVA）PBS 溶液致敏激發(fā)制備哮喘小鼠模型（普遍公認(rèn)的制模方法[8]）；C 組在第1 次腹腔注射OVA 氫氧化鋁PBS 溶液前10 min 及第1 次霧化OVA PBS 溶液激發(fā)前10 min，經(jīng)鼠尾靜脈注射過繼輸入TCR-β-/-小鼠經(jīng)生理鹽水霧化后提取的γδT細(xì)胞，每次鼠尾注射1×106個γδT 細(xì)胞；D 組在第1 次腹腔注射OVA 氫氧化鋁PBS 溶液前10 min 及第1 次霧化OVA PBS 溶液激發(fā)前10 min，經(jīng)鼠尾靜脈注射過繼TCR-β-/-小鼠經(jīng)母牛分枝桿菌霧化后提取的γδT 細(xì)胞，每次鼠尾靜脈注射1×106個γδT細(xì)胞，溶于1 mL生理鹽水中；對照組腹腔注射及霧化均用等量PBS代替，鼠尾注射用等量生理鹽水代替；每組每只小鼠共計注射5 次。最后1 次霧化后24 h 內(nèi)檢測氣道反應(yīng)性，用10%水合氯醛0.1 mL 腹腔注射麻醉后處死小鼠，該操作符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），酶聯(lián)免疫吸附測定實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢 測BALF 的IL-13 和IL-5 的水平。取肺組織、固定、切片、染色，觀察肺內(nèi)炎癥浸潤的病理情況；然后用免疫組化法檢測肺組織中T-bet/GATA3的表達(dá)水平。

1.3 小鼠氣道反應(yīng)性測定

打開電腦以及肺功能儀，校準(zhǔn)儀器，檢測肺功能儀密閉艙環(huán)境狀態(tài)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)：設(shè)置小鼠ID，將它們分到相應(yīng)的A 組、B 組、C 組、D 組中；用PBS和6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 4 個乙酰甲膽堿的濃度霧化激發(fā)，霧化量為20 μL，小鼠在肺功能儀密閉艙內(nèi)適應(yīng)時間為5 min；霧化，記錄時間為3 min，下一步霧化前，小鼠恢復(fù)時間為4 min；把小鼠裝入肺功能儀密閉艙內(nèi)，為防止小鼠窒息死亡打開密閉艙氣流閥通氣，之后開始測量；小鼠檢測完，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，分析小鼠氣道反應(yīng)性。小鼠的氣道反應(yīng)性是以乙酰甲膽堿相應(yīng)濃度激發(fā)下的特殊氣道阻力（specific resistance airway，sRaw）平均值與PBS 激發(fā)下的特殊氣道阻力平均值來反應(yīng)的。公式：sRaw 值＝Mch SRAW 值-PBS SRAW值，單位：cmH2O/（L·s）。

1.4 標(biāo)本采集

小鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后氣管插管，用預(yù)冷至4 ℃的PBS 0.5 mL 灌洗，緩慢注入氣管，緩慢回收BALF，重復(fù)2 次，回收率＞85%，在-80 ℃冰箱保存。取小鼠左肺組織，用4%多聚甲醛浸泡固定，脫水、包埋，切片約4 μm，進(jìn)行蘇木精—伊紅（hematoxylin-eosin，HE）和過碘酸—雪夫（periodic acid Schiff，PAS）染色，余肺葉放置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肺部病理組織學(xué)檢查

取左肺組織，固定，石蠟包埋、切片，做HE 和PAS染色，光鏡下觀察肺部炎癥情況。

1.6 ELISA法檢測BALF 中IL-13、IL-5 水平

按照說明書提供的方法操作，酶標(biāo)儀檢測450 nm 光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出細(xì)胞因子IL-13、IL-5濃度。

1.7 免疫組化

脫蠟脫水，自來水沖洗，重復(fù)2 次，切片放在架子，浸泡至0.01 mol/L（pH=6.0）枸櫞酸緩沖液盒中，放入高壓鍋高壓10 min修復(fù)。至修復(fù)完成，緩慢放氣開蓋，梯度冷卻，PBS 洗滌5 min，重復(fù)2 次，置于3%雙氧水中浸泡10 min，PBS沖洗5 min，重復(fù)2次，5%BSA 封閉液浸泡10 min；甩干破片上液體，按說明書推薦濃度將一抗加到組織上，4 ℃冰箱過夜；次日，室溫條件下30 min以上放置，PBS沖洗5 min，重復(fù)2次，甩干組織上液體，按說明書推薦量將二抗滴在組織上，孵育在37 ℃恒溫箱中15 min，PBS 沖洗5 min，重復(fù)2次；甩掉組織上液體，按照說明書推薦量加DAB 顯色劑浸泡5 min。沖洗自來水，蘇木精浸泡1 min，自來水洗滌3 min，1%鹽水酒精浸泡3 s分化，自來水沖洗3 min。自來水浸泡10 min反藍(lán)，晾干封片，顯微鏡下觀察肺組織并用Image J軟件分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)，Prism 5.0 軟件處理圖表。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)先做方差齊性檢驗，結(jié)果符合正態(tài)分布及方差齊用One-way ANOVA 比較組間差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，用Pearson相關(guān)性檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠氣道反應(yīng)性

B 組小鼠在12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL濃度下經(jīng)Mch激發(fā)的氣道反應(yīng)性高于A組，sRaw增長值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相比于B 組，D 組sRaw 增長值降低（P＜0.05），而與C 組比較差異不明顯（P＞0.05）（圖1）。

圖1 小鼠肺功能比較

2.2 肺部病理表現(xiàn)

B組可見支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤較明顯，支氣管管腔狹窄，管壁增厚；經(jīng)鼠尾過繼注入γδT 后，D 組與B 組對比氣道炎癥水平下降，支氣管及血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤明顯減輕。PAS 染色顯示：A組小鼠支氣管氣道上皮無杯狀細(xì)胞增生，無黏液滲出；B 組可見明顯杯狀細(xì)胞增生，黏液滲出較多；D 組與B 組對比，支氣管管腔內(nèi)杯狀細(xì)胞減少，腔內(nèi)黏液滲出減輕；C 組相比B 組差異不明顯（圖2）。提示過繼經(jīng)母牛分枝桿菌化免疫后的γδT細(xì)胞對哮喘小鼠模型可能具有預(yù)防作用。

圖2 小鼠肺組織HE（×200）和PAS染色（×400）

2.3 肺組織中T-bet/GATA3表達(dá)情況

B組肺組織T-bet表達(dá)水平低于A組，而GATA3表達(dá)水平高于A組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；D組肺組織T-bet表達(dá)水平高于B組，GATA3表達(dá)水平低于B 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；C 組與B 組無明顯差異（P＞0.05），見圖3。提示過繼經(jīng)母牛分枝桿菌化免疫后的γδT細(xì)胞可調(diào)節(jié)哮喘小鼠模型T-bet/GATA3表達(dá)。

圖3 免疫組化法檢測肺組織中T-bet、GATA3的表達(dá)水平

2.4 BALF 中IL-13、IL-5表達(dá)水平

B 組BALF 中IL-13、IL-5 水平高于A 組（P＜0.05）；D組BALF 中IL-13、IL-5水平低于B組（P＜0.05）；C組與B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4 和圖5。提示過繼經(jīng)母牛分枝桿菌化免疫后的γδT細(xì)胞可調(diào)節(jié)哮喘小鼠模型的IL-13、IL-5的表達(dá)。

圖4 小鼠BALF中IL-13表達(dá)水平

圖5 小鼠BALF中IL-5表達(dá)水平

3 討論

哮喘病因比較復(fù)雜，多種細(xì)胞和細(xì)胞因子都可能是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因素。IL-5 和IL-13 與過敏性哮喘有著緊密的聯(lián)系[9]，臨床研究發(fā)現(xiàn)IL-13、IL-5參與哮喘炎癥反應(yīng)[10]，哮喘患者的肺組織、痰和血清中IL-5 和IL-13 水平明顯高于正常人，并且其水平與病情的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。已經(jīng)有研究表明，γδT 細(xì)胞參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展過程[11]。γδT 細(xì)胞主要分布在皮膚、黏膜等表面組織，同時也是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞[12]。γδT 細(xì)胞在胸腺發(fā)育，在胎兒時期已經(jīng)具備免疫效應(yīng)，出生之后γδT 細(xì)胞逐漸向皮膚，肺部，舌，消化道黏膜等部位轉(zhuǎn)移[13]。此外，轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA3 與Th1/Th2 失衡有著密切聯(lián)系[14]。Th1 細(xì)胞和Th2 效應(yīng)細(xì)胞均是由Th0 細(xì)胞分化而來[15]，該過程受到T-bet/GATA3的調(diào)控[16]，而且GATA3只在Th2中表達(dá)[17]。本研究針對γδT細(xì)胞的黏膜免疫特點，通過霧化吸入途徑制備母牛分枝桿菌免疫后的γδT 細(xì)胞，再過繼（鼠尾靜脈注射）干預(yù)哮喘小鼠模型的形成（主要以氣道反應(yīng)性、支氣管肺病理改變以及哮喘相關(guān)細(xì)胞因子為評價指標(biāo)，判定干預(yù)效果），并進(jìn)一步探討了母牛分枝桿菌對T-bet/GATA3以及IL-13、IL-5表達(dá)的影響。

霧化吸入滅活草分枝桿菌可以調(diào)節(jié)氣道炎癥反應(yīng)，緩解哮喘癥狀[18]。母牛分枝桿菌與滅活草分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，有著相似的免疫調(diào)節(jié)作用，基于藥品的來源，本實驗使用“注射用母牛分枝桿菌”。結(jié)果表明，D組相比于B組及C組氣道反應(yīng)性明顯降低；支氣管及肺組織炎性細(xì)胞浸潤較輕，杯狀細(xì)胞及黏液滲出減少；肺組織T-bet蛋白表達(dá)升高、GATA3表達(dá)下降；BALF的IL-13、IL-5水平顯著下降。進(jìn)一步證明了霧化吸入分枝桿菌疫苗對哮喘模型形成的預(yù)防作用，γδT 細(xì)胞在哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，同時也提示其與T-bet/GATA3 以及IL-13、IL-5有一定相關(guān)性。

（本實驗于廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心完成，感謝實驗室老師的指導(dǎo)和幫助!）