黃可馨，羅 丹，王慧豐，魏銀鋒，華毅明，謝 博，羅海瓊△，陳慶鋒

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.信息與管理學(xué)院；2.生命科學(xué)研究院；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；4.廣西大學(xué)計(jì)算機(jī)與電子信息學(xué)院，南寧 530004）

前列腺癌是一種惡性腫瘤，常見于歐美等西方國家。近年來，由于生活水平，醫(yī)療水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)西化以及前列腺癌早期診斷方法的進(jìn)步，前列腺癌在我國的發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)快速增長的趨勢[1]。前列腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的不明確給前列腺癌的治療帶來很大困難，常規(guī)的治療手段如內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療等方法主要以改善臨床癥狀，提高患者生活質(zhì)量為主[2]。目前還沒有能從根本上治療前列腺癌的方法。細(xì)胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）是一種以鐵原卟啉為輔基的B 族細(xì)胞色素，因其還原態(tài)與一氧化碳（CO）作用后形成的復(fù)合物在450 nm 波長處產(chǎn)生特異吸收峰而命名。細(xì)胞色素CYP450酶在很多前致癌物和抗癌物質(zhì)的代謝活化和代謝消除中發(fā)揮著重要作用[3]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對前列腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，從核酸和蛋白質(zhì)層面分析蘊(yùn)含在其中的結(jié)構(gòu)功能信息。迄今為止，作為世界上最大的存儲高通量分子數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫GEO已收錄了205萬個樣本的數(shù)據(jù)，涉及16億個基因表達(dá)豐度數(shù)據(jù)，涵蓋500多種生物體，廣泛覆蓋各種生物學(xué)內(nèi)容[4]。本研究通過GEO 的基因數(shù)據(jù)集，篩選在藥物代謝細(xì)胞色素P450 通路和細(xì)胞色素P450 對外來異物的代謝通路上共同的差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步進(jìn)行生物信息挖掘，為前列腺癌的發(fā)生機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù) National Center for Biotechnology Information 又稱NCBI，GEO 數(shù)據(jù)庫全稱Gene Expression Omnibus，是由美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI 創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫。NCBI-GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是一個免費(fèi)的微陣列/基因圖譜公共數(shù)據(jù)庫。通過GEO數(shù)據(jù)庫搜索prostate cancer（查詢?nèi)掌冢?020 年10 月16日），篩選來自臨床的樣本，然后就可獲取到臨床的前列腺癌樣本數(shù)據(jù)。本課題組查找獲得了GSE46602[5]、GSE32571[6]和GSE70768[7]3 個數(shù)據(jù)集并進(jìn)行分析。GSE46602、GSE32571 和GSE70768的微陣列數(shù)據(jù)基于GPL570 平臺、GPL6947 平臺和GPL10558 平臺，其中包括3 個數(shù)據(jù)集分別為36 例前列腺癌組織（prostate cancer，PCa）和14 例癌旁組織，138例PCa組織和118例良性組織，126例PCa組織和73例良性組織。

1.2 前列腺癌數(shù)據(jù)的處理 本研究以前列腺癌組織為實(shí)驗(yàn)組，良性組織為對照組，通過GEO2R分析工具對PCa標(biāo)本與正常前列腺標(biāo)本之間的差異表達(dá)基 因（difference expression genes，DEGs）進(jìn)行篩選[8]。當(dāng)P＜0.05時具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且該值越小越好。FC（fold change）表示兩樣本間表達(dá)量的比值，一般默認(rèn)取絕對值大于1 為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)闃颖玖枯^小，所以把范圍縮小到-0.5 到0.5 之間[9]。log2FC小于-0.5的基因是下調(diào)基因，在腫瘤組織中屬于低表達(dá)，大于0.5就是上調(diào)基因，因此將篩選條件調(diào)整為P＜0.05 且|log2FC|＞0.5。通過篩選得到共同表達(dá)在藥物代謝—細(xì)胞色素P450 通路和細(xì)胞色素P450對外來異物的代謝通路的DEGs。

1.3 關(guān)鍵基因的篩選 將篩選所得的DEGs 導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）獲得蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作圖，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0進(jìn)行可視化分析，利用Cytoscape 插件MCODE 獲取顯著相互作用模塊，設(shè)置參數(shù)為MCODE scores＞7、Degree cutoff=2、Node score cutoff=0.2、K-score=2、Max.depth=100。

1.4 GEPIA 分析 GEPIA 數(shù)據(jù)庫是基于利用TCGA 數(shù)據(jù)做可視化分析的工具，通過獲取TCGA 中DEGs相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析比較關(guān)鍵基因在腫瘤組織與正常組織的差異，P＜0.01，F(xiàn)old Change＞1，被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 UALCAN分析 Gleason分級是一種被廣泛采用的前列腺癌組織學(xué)分級的方法，Gleason評分是根據(jù)腺體分化程度按5 級評分，分?jǐn)?shù)越高腺體分化程度越低。為驗(yàn)證基因mRNA 表達(dá)與PCa 患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）分析前列腺癌組織中6 個DEGs 的mRNA表達(dá)（查詢?nèi)掌冢?020年10月29日）。采用t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析6 個基因的mRNA 表達(dá)與前列腺癌Gleason 分級是否有相關(guān)性，具有明顯相關(guān)性時可以認(rèn)為基因mRNA 的表達(dá)差異與不同Gleason 分級有關(guān)，這6個基因在臨床治療中就有意義。

1.6 人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫（the human protein atalas，HPA）分析 在驗(yàn)證了前列腺癌中DEGs 的mRNA 表達(dá)后，學(xué)者試圖通過HPA[10]（https://www.proteinatlas.org/）探索前列腺癌中6 個DEGs 的蛋白表達(dá)（查詢?nèi)掌冢?020 年11 月2 日），利用HPA 篩選獲得在前列腺癌組織中差異表達(dá)的蛋白。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 本實(shí)驗(yàn)采用羅氏High Pure Viral RNA Kit 提取前列腺癌旁組織正常細(xì)胞RWPE-1，以及前列腺癌細(xì)胞DU145、C4-2、LNCaP的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，然后以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)。嚴(yán)格按照SYBR Green RT-qPCR試劑盒進(jìn)行操作，反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaq Ⅱ（2×）10 μL，cDNA 1 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，dH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃10 min，循環(huán)1次；95 ℃15 s，61 ℃60 s，72 ℃10 s，共循環(huán)40次。GSTM1、GSTM5、GSTP1以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算GSTM1、GSTM5、GSTP1的相對表達(dá)量。根據(jù)NCBI 中GSTM1、GSTM5、GSTP1的序列號（Gene ID:2944、Gene ID:2949和Gene ID:2950），利用Primer primer 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，均由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌中差異表達(dá)基因的篩選 本研究選擇3 個基因表達(dá)譜系列（GSE46602、GSE32571 和GSE70768），共有300個PCa組織和205個正常前列腺組織。通過GEO2R 工具，對從GSE46602、GSE32571、GSE70768 中提取了5628、5559 和9515個DEGs分析，獲得368個差異表達(dá)基因，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因維恩圖

2.2 多套公共數(shù)據(jù)的差異整合分析 本研究選擇3 個基因表達(dá)譜系列（GSE46602、GSE32571 和GSE70768），篩選在藥物代謝—細(xì)胞色素P450通路和細(xì)胞色素P450 對外來異物的代謝通路上共同差異表達(dá)的基因。在藥物代謝—細(xì)胞色素P450 通路上的差異表達(dá)基因有ALDH3B2、FMO5、GSTP1、CYP3A5、GSTM1、GSTM5、GSTM2、AOX1、MGST3，在細(xì)胞色素P450 對外來異物的代謝通路上的基因有ALDH3B2、GSTP1、CYP3A5、GSTM1、GSTM5、GSTM2、MGST3。在藥物代謝—細(xì)胞色素P450 通路和細(xì)胞色素P450 對外來異物的代謝通路上共同表達(dá)的差異基因包括ALDH3B2、GSTP1、CYP3A5、GSTM1、GSTM5、GSTM2、MGST3。

2.3 PPI 模塊的分析 通過Cytoscape 獲得顯著相互作用模塊（圖2），包含7個節(jié)點(diǎn)、21條邊，7個關(guān)鍵基因分別為ALDH3B2、GSTP1、CYP3A5、GSTM1、GSTM5、GSTM2、MGST3。結(jié)果顯示，在細(xì)胞色素P450相關(guān)通路上共同表達(dá)的7個DEGs之間具有相互作用的關(guān)系。

圖2 PPI模塊的分析結(jié)果

2.4 共同差異表達(dá)基因的TCGA 數(shù)據(jù)的驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上獲取的P450 相關(guān)通路的基因表達(dá)，本課題組進(jìn)一步在TCGA 樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。GEPIA法即基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析，是一個新開發(fā)的用于癌癥和正?；虮磉_(dá)譜分析和交互分析的web服務(wù)器[11]。GEPIA是利用TCGA數(shù)據(jù)做可視化分析中比較著名的一款在線工具，它可以檢測同時富集在藥物代謝—細(xì)胞色素P450 通路和細(xì)胞色素P450 對外來異物的代謝通路的7 個基因（ALDH3B2、GSTP1、CYP3A5、GSTM1、GSTM5、GSTM2、MGST3）在前列腺癌組織和正常前列腺組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常前列腺組織相比，7個基因中有6 個基因（ALDH3B2、CYP3A5、GSTM1、GSTM2、GSTM5、GSTP1）在正常組織與前列腺癌組織中的表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見 圖3，而MGST3基因的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 共同差異表達(dá)基因的TCGA數(shù)據(jù)的驗(yàn)證結(jié)果

2.5 mRNA 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 為了驗(yàn)證基因的mRNA 表達(dá)在前列腺癌治療中的臨床意義，采用Ualcan[12]對6 個基因（ALDH3B2、CYP3A5、GSTM1、GSTM2、GSTM5、GSTP1）的mRNA 表達(dá)與前列腺癌Gleason分級是否有相關(guān)性進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，6個基因的mRNA表達(dá)與Gleason分級明顯相關(guān)，并且隨著Gleason 評分的升高，除ALDH3B2外，所有mRNA 表達(dá)量有不斷降低的趨勢。在6 個基因中，低分化的前列腺癌都傾向于有更低的mRNA 的表達(dá)，在Gleason 評分為10 的低分化前列腺癌中尤為明顯，見圖4。

圖4 mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.6 蛋白表達(dá) 將6 個DEGs 導(dǎo)入人蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜，選擇前列腺癌組織，獲得3 個DEGs 在前列腺癌組織中表達(dá)的蛋白，包括GSTM1、GSTM5、GSTP1，這些來自前列腺癌臨床數(shù)據(jù)的蛋白在正常前列腺組織和前列腺癌組織中均有表達(dá)，見圖5。GSTM1、GSTM5、GSTP1 均在正常前列腺組織中高表達(dá)，而在前列腺癌組織中則可以觀察到它們的中等表達(dá)和不表達(dá)。由此結(jié)果顯示，在前列腺癌患者中GSTM1、GSTM5、GSTP1的蛋白質(zhì)表達(dá)為低表達(dá)。

圖5 GSTM1、GSTM5、GSTP1蛋白表達(dá)情況

2.7 RT-qPCR 檢測結(jié)果 基于運(yùn)用RT-qPCR 驗(yàn)證3 個關(guān)鍵差異基因（GSTM1、GSTM5、GSTP1）的mRNA表達(dá)情況。與前列腺癌旁正常細(xì)胞RWPE-1相比，GSTM1和GSTP1在不同的前列腺癌細(xì)胞（DU145、C4-2、LNCaP）中mRNA 表達(dá)下降。前列腺癌細(xì)胞和癌旁正常細(xì)胞表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），GSTM5 在DU145 細(xì)胞株中的mRNA 表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在C4-2、LNCaP 中的mRNA 表達(dá)雖然下降但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 RT-qPCR檢測結(jié)果

3 討論

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫收集到前列腺癌的GSE46602、GSE32571、GSE707683 個數(shù)據(jù)集，共獲得300 份前列腺癌組織數(shù)據(jù)和205 份正常組織數(shù)據(jù)。運(yùn)用GEO2R工具對3個數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，得到P＜0.05的差異表達(dá)基因。運(yùn)用GEPIA對富集在藥物代謝—細(xì)胞色素P450和細(xì)胞色素P450對外來異物的代謝通路的7 個基因進(jìn)行箱式圖分析，其中有6 個基因在前列腺癌中的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，細(xì)胞色素P450同工酶被認(rèn)為是前列腺癌治療和預(yù)防的潛在指標(biāo)[13]。對富集在藥物代謝—細(xì)胞色素P450通路和細(xì)胞色素P450對外來異物的代謝通路的基因進(jìn)行研究，有可能獲得前列腺癌治療相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)這6 個基因的Gleason分級研究與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，再通過HPA數(shù)據(jù)庫分析6 個差異表達(dá)基因，最后得到有3 個差異表達(dá)基因在前列腺癌中表達(dá)。采用RT-qPCR 技術(shù)驗(yàn)證前列腺癌細(xì)胞株中3 個差異表達(dá)基因（GSTM1、GSTP1、GSTM5基因）mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與RWPE-1 相比，GSTM1和GSTP1差異表達(dá)基因在不同的前列腺癌細(xì)胞（DU145、C4-2、LNCaP）中基因表達(dá)下降（P＜0.05），GSTM5差異表達(dá)基因雖然在不同的前列腺癌細(xì)胞中基因表達(dá)下降但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

GSTM1編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M 1蛋白，它是前列腺癌的風(fēng)險因素之一。與正常組織相比，在前列腺癌組織中低表達(dá)。通過KEGG 分析得到GSTM1在多個通路富集，主要包括藥物代謝—細(xì)胞色素P450，藥物代謝—其他酶，細(xì)胞色素P450對外來物質(zhì)的代謝作用等通路。GSTM1 富集的藥物代謝相關(guān)的細(xì)胞色素P450通路與前列腺癌有關(guān)，并且細(xì)胞色素P450 家族的CYP3A4 和CYP3A5 在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)降低[14]。由此可猜測GSTM1 有可能在細(xì)胞色素P450 代謝通路參與表達(dá)并進(jìn)而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。

GSTP1、GSTM5都可以編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶pi 1，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是一類酶，通過催化許多疏水性和親電子化合物與還原型谷胱甘肽的結(jié)合，在排毒中起重要作用，在細(xì)胞凋亡，增殖，分化中也起著重要作用。研究顯示，GSTP1的低表達(dá)與前列腺癌生物標(biāo)志物c-myc 的高表達(dá)有關(guān)，GSTP1的過表達(dá)通過靶向c-myc對前列腺癌有保護(hù)作用[15]。GSTM5參與前列腺癌的生物學(xué)過程，在前列腺癌的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。相比于正常組織，在前列腺癌中GSTP1低表達(dá)，屬于下調(diào)基因。GEPIA分析顯示GSTP1，GSTM5 在前列腺癌中的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過RT-qPCR 技術(shù)驗(yàn)證，得出GSTM5 雖然在不同的前列腺癌細(xì)胞中基因表達(dá)下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。關(guān)于與前列腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制有關(guān)的研究較少，有潛在的研究價值。

基于生物信息學(xué)分析的研究發(fā)現(xiàn)，GSTM1、GSTP1、GSTM5基因在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，其在前列腺癌中的低表達(dá)預(yù)示著它們有望成為前列腺癌的治療靶點(diǎn)。雖然本研究最終得到部分差異表達(dá)基因，通過研究差異基因的表達(dá)可以初步了解前列腺癌的發(fā)生，但是對于研究前列腺癌復(fù)雜的發(fā)生發(fā)展過程還需要繼續(xù)進(jìn)行其他體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，之后才能為前列腺癌的診斷、治療、預(yù)后提供確實(shí)有效的研究依據(jù)。