鄭世榜，李永強(qiáng)，廖思娜，邱 華，廖小莉

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

乙型肝炎病毒（HBV）是一種噬肝DNA 病毒，可引起急性或慢性肝損傷[1]。當(dāng)前，中國(guó)仍有慢性HBV感染者約7 000萬(wàn)例，每年因HBV相關(guān)性肝硬化、肝癌、肝衰竭死亡的患者達(dá)30 萬(wàn)人[2-3]。由于抗病毒藥物核苷（酸）類似物、干擾素尚不能清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV 病毒復(fù)制的模板cccDNA（covalently closed circular DNA），因此，探尋治愈HBV 及相關(guān)疾病的靶點(diǎn)或藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

microRNA 是一種新發(fā)現(xiàn)的宿主與乙肝病毒（HBV）相互作用的新機(jī)制。前期研究表明，miR-122 作為肝臟中最特異、最豐富的microRNA，參與肝臟發(fā)育、分化和穩(wěn)態(tài)以及代謝功能；在調(diào)控HBV復(fù)制及HCC中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]。本課題組前期成功篩選的HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14能為HBV相關(guān)肝硬化和肝癌的發(fā)病機(jī)制探索、治療靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和候選藥物篩選等方面提供新的研究工具[5]?；诖耍瑸橄到y(tǒng)探索miR-122與新的HBV 體外感染與復(fù)制模型HepGA14 上HBV表達(dá)活性的關(guān)系及調(diào)控機(jī)制，本研究采用miR-122 過(guò)表達(dá)/干擾表達(dá)慢病毒質(zhì)粒干預(yù)后，觀察HBVDNA、HBsAg、HBeAg 等標(biāo)志物表達(dá)功能的變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2 細(xì)胞、293T 細(xì)胞購(gòu)自上海諾百生物科技有限公司；HBV全基因組1.3倍體HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14 細(xì)胞由課題組前期構(gòu)建[5]；PDS019_pL 和PDS165_pL6.3-GFP-U6-TuD2 載 體購(gòu)自上海溪照生物科技有限公司，內(nèi)切酶、GeneRuler DNA Ladder、Rnase Inhibitor和T4 DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；質(zhì)粒小抽試劑盒以及凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；0.05%Trypsin和lipofectamine 2000 購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自法國(guó)Biowest 公司；Opti-MEM 購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；引物Oligo、Trizol Reagent、熒光染料SYBR Green I、oligo dT/Random primer/特異性引物、逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptIII Reverse Transcriptase、Platinum Taq DNA Polymerase、100mM dNTPs、DEPC H2O 購(gòu)自美國(guó)invitrogen 公司；基因序列、引物合成、測(cè)序交由上海諾百生物科技有限公司完成；HBeAg、HBsAg 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海東寰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T 細(xì)胞、HepG2 和HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%小牛血清的DEME培養(yǎng)基中。

1.2.2 miR-122 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 miR-122 的成熟序列來(lái)自Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)（miRBase），設(shè)計(jì)miR-122 的過(guò)表達(dá)Oligo，正向引物PDS19-miR122-F：5'-CACCGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGCGAACAAACACCATTGTCACACTCCA-3'，反向引物PDS19-miR122-R：5'-AAAATGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTTCGCAAACACCATTGTCACACTCCAC-3'，酶切位點(diǎn)為BsmBI。以含有待擴(kuò)增序列的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25 μL 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Primer F/R 1 μL，Taq DNA polymerase 0.25 μL，（10 mmol/L）dNTPs 0.25 μL，Nuclease free water 18 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)：95 ℃變性20 s；67 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延長(zhǎng)3 min，4 ℃保存。經(jīng)退火后，重組至PDS019_pL 載體中，測(cè)序驗(yàn)證。退火反應(yīng)體系：10×Oligo Annealing Buffer 2 μL，引 物F（200 μmol/L）5 μL，引物R（200 μmol/L）5 μL，ddH2O 8 μL。退火反應(yīng)條件：95 ℃5 min，72 ℃5 min，自然降溫至PCR 的Block 溫度（25 ℃）。

1.2.3 miR-122干擾載體構(gòu)建 設(shè)計(jì)miR-122的干擾Oligo，正向引物PDS165-shmiR122-F：5'-CAACCAAACACCATTGTCACACTCCA-3'，反向引物PDS-165-shmiR122-R：5'-CTTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3'。正向引物酶切位點(diǎn)為BsmBI，反向引物酶切位點(diǎn)為BveI。以含有待擴(kuò)增序列的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25 μL 反應(yīng)體系以及PCR 反應(yīng)條件同“1.2.2項(xiàng)”。經(jīng)退火后，重組至PDS 165_pL6.3-GFP-U6-TuD2 載體中，測(cè)序驗(yàn)證。退火反應(yīng)體系以及退火反應(yīng)條件同“1.2.2項(xiàng)”。

1.2.4 miR-122 過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒包裝和滴度測(cè)定 構(gòu)建好的miR-122 過(guò)表達(dá)/干擾慢病毒載體分別與包裝質(zhì)粒（packaging mix）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝慢病毒，收集病毒液，48 h 后測(cè)定慢病毒活性滴度。RT-qPCR 反應(yīng)體系：ddH2O 6.55 μL、10×PCR buffer 1 μL、Mg2+（50 mmol/L）0.4 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL、Primer F/R（10 μmol/L）0.5 μL、Probe（FAM）（10 μmol/L）0.25 μL、Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL、Template 1 μL、Total volume 10 μL；RT-qPCR反應(yīng)條件：95 ℃10 s、60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 miR-122 過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒侵染HBV 1.3D-HepG2細(xì)胞及抗生素篩選

（1）慢病毒侵染HBV全基因組1.3倍體HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14 最佳MOI 值:含8μg/mL polybrene 的完全培養(yǎng)液重懸靶細(xì)胞，按每孔第2 天細(xì)胞密度60%～70%的數(shù)量接種于96 孔板的各孔，設(shè)1個(gè)復(fù)孔。取出陰性對(duì)照病毒液，冰上融化，慢病毒MOI=0、2、5、10、30、60、120、240，向每孔加入病毒液。培養(yǎng)6 h 后，更換成完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h～96 h；熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)，明確最佳MOI，并拍攝白光和熒光視野下照片。（2）抗生素篩選:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepGA14細(xì)胞，以5×105/孔密度接種于12孔板;培養(yǎng)孔換上新配制的完全培養(yǎng)基+8 μg/mL ploybrene 的感染培養(yǎng)基，按照MOI 測(cè)定值的病毒液侵染HepGA14 細(xì)胞，培養(yǎng)4～6 h，更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，加入梯度為0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL 的抗生素進(jìn)行篩選;根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)確定抗生素篩選周期，培養(yǎng)和凍存篩選成功的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.2.6 RT-qPCR 檢測(cè)miR-122 表達(dá)量 使用Hep-GA14 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和同樣細(xì)胞數(shù)的HepG2 細(xì)胞沉淀，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA 放-20 ℃?zhèn)溆帽４?。采用RT-qPCR 法對(duì)miR-122 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共25 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，正向 反向引物（10 μmol）各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s；40 個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。miR-122正向引物序列為：5'-ACACTCCAGCTGGGTGGAGTGTGACAATGG-3'，反向引物序列為：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 正向引物序列為：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)miR-122過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒侵染HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14的miR-122表達(dá)量 miR-122過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒分別以MOI 值=30 侵染HepGA14 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，48 h 后收集部分細(xì)胞，qPCR 檢測(cè)miR-122 表達(dá)水平，檢測(cè)方法同“1.2.6項(xiàng)”，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 ELISA 檢測(cè)上清HBsAg 和HBeAg 水平 收集細(xì)胞上清，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 RT-qPCR檢測(cè)上清HBV DNA表達(dá)量 提取細(xì)胞沉淀的總RNA，采用RT-qPCR 檢測(cè)HBV DNA的表達(dá)水平，HBV DNA 的檢測(cè)引物的正向引物為5'-CTCGTGGTGGACTTCTCTC-3'，反向引物為：5'-CAGCAGGATGAAGAGGAA-3'，以18S rDNA 為內(nèi)參，擴(kuò)增引物為引物18S-F（序列5'-GAATTGACGGAAGGGCACCAC-3'）和18S-R（序 列5'-AAGAACGGCCATGCACCACCA-3'）。采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-122 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 獲得測(cè)序正確的miR-122 過(guò)表達(dá)慢病毒載體CL1044-PDS19_miR122。測(cè)序結(jié)果完全符合，無(wú)突變，表明miR-122過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

圖1 CL1044-PDS19_miR122 載體的測(cè)序圖譜

2.2 miR-122 干擾載體構(gòu)建 獲得測(cè)序正確的miR-122 干擾慢病毒載體CL1043-PDS160_shmiR122。測(cè)序結(jié)果完全符合，無(wú)突變，表明miR-122干擾慢病毒載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

圖2 CL1043-PDS160_shmiR122 載體的測(cè)序圖譜

2.3 慢病毒滴度及侵染HBV 全基因組1.3 倍體HBV 穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14 細(xì)胞的MOI 測(cè)定 濃縮后的慢病毒侵染293A細(xì)胞，48 h后抽提細(xì)胞基因組。測(cè)定病毒滴度為3.24×108TU/mL。MOI=30～60時(shí)，綜合分析細(xì)胞狀態(tài)較好，陽(yáng)性比例達(dá)到85%以上，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖3。選取MOI=30進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 慢病毒侵染HepGA14 細(xì)胞的侵染效率

2.4 HepG2和HBV1.3D-HepGA14細(xì)胞miR-122表達(dá)量 HBV1.3D-HepGA14細(xì)胞來(lái)源于HepG2 并穩(wěn)定含有轉(zhuǎn)染的HBV 全長(zhǎng)基因組（ayw 亞型）。本研究使用HBV1.3D-HepGA14 細(xì)胞作為HBV 復(fù)制的模型系統(tǒng)，因?yàn)樗芙M成性表達(dá)乙型肝炎表面（HBsAg）抗原和E（HBeAg）抗原，并且還支持HBV復(fù)制，HBx、cccDNA、HBVDNA 的表達(dá)豐度更高[5]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV1.3D-HepGA14 細(xì)胞（0.244±0.005）比在HepG2 細(xì)胞（1.000±0.018）中miR-122 的水平下降了70%多（t=71.467，P＜0.000 1），見(jiàn)圖4。表明HBV 復(fù)制和感染的存在可能導(dǎo)致miR-122 表達(dá)下降。

圖4 RT-PCR 檢測(cè)HBV1.3D-HepGA14 細(xì)胞中miR-122 RNA的表達(dá)情況

2.5 miR-122 過(guò)表達(dá)/干擾慢病毒侵染HBV1.3DHepGA14 細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞 miR-122 過(guò)表達(dá)/干擾慢病毒侵染HepGA14 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞可上下調(diào)miR-122 表達(dá)。與HepGA14（對(duì)照組）比較，HepGA14-VL1044（過(guò)表達(dá)組）miR-122可上調(diào)達(dá)到779倍（t=-22.878，P＜0.000 1），HepGA14-VL1043（干擾組）干擾效率可到55.03%（t=30.125，P＜0.000 1），見(jiàn)圖5。

圖5 miR-122 過(guò)表達(dá)/干擾慢病毒侵染HBV1.3D-HepGA14細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞

2.6 過(guò)表達(dá)和干擾miR-122對(duì)HBVDNA復(fù)制、HBsAg 表達(dá)和HBeAg 表達(dá)的影響 與對(duì)照組Hep-GA14 細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)miR-122 后HBV DNA（t=95.925，P＜0.000 1）、HBeAg（t=92.338，P＜0.000 1）、HBsAg（t=60.706，P＜0.000 1）的表達(dá)均下降。干擾miR-122 后HBV DNA（t=-45.084，P＜0.000 1）、HBeAg（t=-22.512，P＜0.000 1）、HBsAg（t=-44.146，P＜0.000 1）的表達(dá)均上升。RT-qPCR 檢測(cè)細(xì)胞上清HBV DNA表達(dá)結(jié)果和ELISA法檢測(cè)3種細(xì)胞上清HBsAg和HBeAg表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 過(guò)表達(dá)和干擾miR-122對(duì)HBVDNA復(fù)制、HBsAg表達(dá)和HBeAg表達(dá)的影響

3 討論

目前，我國(guó)乙型肝炎病毒（簡(jiǎn)稱乙肝）的患病率仍高于其他國(guó)家的平均水平。而臨床指南一線推薦的兩大抗病毒用藥干擾素和核苷（酸）類似物都無(wú)法干預(yù)到超螺旋結(jié)構(gòu)cccDNA（HBV 基因組物質(zhì)），這成為了慢性乙型肝炎難以治愈的主要原因[6]。然而，乙肝患者體內(nèi)持續(xù)存在的HBV病毒，是發(fā)展為原發(fā)性肝癌（HCC）的最主要的危險(xiǎn)因素。因此，尋找以及研究靈敏的分子標(biāo)志物有助篩選早期的乙肝患者，給予合適的治療，延緩疾病的進(jìn)展，是目前臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

乙型肝炎病毒屬于嗜肝DNA病毒科，其感染人體肝臟后常引起微小RNA 表達(dá)的變化。miR-122作為肝臟獨(dú)有的含量最高的微小RNA，占肝臟微小RNA 總量的近70%[7]。其在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及代謝方面中起著關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，HBV 感染患者肝臟中miR-122 表達(dá)顯著下調(diào)，且隨著miR-122 的表達(dá)水平下降，肝細(xì)胞內(nèi)的HBV 病毒載量和壞死性炎癥會(huì)增加[8]。然而，Ji等[9]發(fā)現(xiàn)miR-122在HBV感染患者的血清中顯著上調(diào)，且可抑制Huh7 和HepG2 細(xì)胞中乙肝病毒的復(fù)制。因此，分析miR-122對(duì)HBV 復(fù)制作用具有重要意義，有助于提高乙肝病毒感染以及相關(guān)疾病患者的療效。

本課題組在前期已經(jīng)成功篩選出HBV 全基因組1.3倍體HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14，較傳統(tǒng)的HepG2.2.15 細(xì)胞株，可更加穩(wěn)定、高效地表達(dá)反映HBV 的復(fù)制/感染情況的標(biāo)志物：HBsAg、HBeAg、HBx、HBVDNA、cccDNA 等。本研究將構(gòu)建的miR-122的過(guò)表達(dá)載體CL1044-PDS19_miR122/CL1043-PDS160_miR122干擾載體轉(zhuǎn)染優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14，并成功建立過(guò)表達(dá)/干擾miR-122 的HepGA14 細(xì)胞系，為研究miR-122 相關(guān)作用機(jī)制提供了良好基礎(chǔ)。檢測(cè)結(jié)果表明，miR-122 過(guò)表達(dá)后對(duì)HepGA14的HBsAg和HBeAg的合成和分泌產(chǎn)生明顯抑制作用，且顯著下調(diào)HBV DNA的滴度，而干擾miR-122后能明顯促進(jìn)HepGA14細(xì)胞的HBsAg、HBeAg的表達(dá)及上調(diào)HBV DNA滴度。表明在細(xì)胞水平上miR-122 能夠調(diào)控HBV 的復(fù)制。本研究的結(jié)果與Chen等[10]團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)論相符。此外，本研究以HepG2、HBV1.3D-HepGA14為研究模型，通過(guò)檢測(cè)其miR-122 表達(dá)，證實(shí)了在乙肝病毒感染的情況下，肝細(xì)胞中miR-122 表達(dá)受到了下調(diào)。miR-122 是HCC 的重要腫瘤抑制因子，與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[11]。Hsu 等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-122 的缺失使小鼠易患肝細(xì)胞癌。Li 等[13]發(fā)現(xiàn)miR-122 在HCC 中低表達(dá)，而將miR-122 過(guò)表達(dá)后會(huì)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、增殖和遷移能力。Wu[14]研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，miR-122可以通過(guò)調(diào)節(jié)I型干擾素（IFN）的表達(dá)來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞免受HBV感染。但miR-122 對(duì)HBV復(fù)制作用尚存有爭(zhēng)議。QIU等[15]學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-122可顯著下調(diào)HO-1的表達(dá)，間接促進(jìn)HBV核心蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)HBV復(fù)制。然而，miR-122被證明通過(guò)降低細(xì)胞周期蛋白G1 的表達(dá)來(lái)間接干擾HBV 的復(fù)制，從而導(dǎo)致p53 介導(dǎo)的HBV 轉(zhuǎn)錄受到抑制[8]。miR-122還被證實(shí)可影響核心蛋白mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，以及前基因體（pgRNA）的穩(wěn)定性，從而抑制HBV基因的表達(dá)/產(chǎn)生[10]。因此，鑒于miR-122在肝臟中的廣泛作用，miR-122調(diào)控HBV的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前，調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)是輔助治療乙型肝炎以及相關(guān)疾病的一個(gè)有前景的前沿領(lǐng)域，可與經(jīng)典抗病毒治療相結(jié)合，使患者獲得更大的收益。本實(shí)驗(yàn)成功建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)/干擾miR-122 的HBV 穩(wěn)轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)單克隆株HepGA14細(xì)胞系，并確定miR-122在細(xì)胞水平上對(duì)HBV 復(fù)制具有一定的調(diào)控作用。但是其如何調(diào)控HBsAg、HBeAg、HBV-DNA 表達(dá)及抗HBV 機(jī)制尚未清楚，需要進(jìn)一步的探索?；谀壳把芯拷Y(jié)果，構(gòu)建的過(guò)表達(dá)/干擾miR-122的HepGA14細(xì)胞模型能為新型抗HBV 藥物的開(kāi)發(fā)提供有力的工具，具有積極的研究意義。