白 雪，劉 露，胡 月，周 帥，霍 然

南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組織胚胎學(xué)學(xué)系，江蘇 南京 211166

生長(zhǎng)階段的卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器大量復(fù)制，RNA、蛋白質(zhì)及能量物質(zhì)大量積累，當(dāng)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)至接近成熟卵子大小時(shí)，卵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)將降至非常低的水平甚至停止，此時(shí)卵母細(xì)胞完成了母源物質(zhì)的積累［1-2］。隨后的卵母細(xì)胞成熟、胚胎基因組激活、早期胚胎發(fā)育和胚胎細(xì)胞譜系的建立均會(huì)受到這些積累的母源物質(zhì)的調(diào)控［3-4］。近年來(lái)，隨著基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對(duì)于母源物質(zhì)的認(rèn)識(shí)逐漸深入，一些關(guān)鍵母源因子的缺失或表達(dá)異常會(huì)嚴(yán)重影響雌性生育能力及胚胎正常發(fā)育。比如，小鼠卵母細(xì)胞中積累的yes-相關(guān)蛋白（yes-associated protein，YAP）對(duì)于胚胎合子基因組的激活至關(guān)重要，利用基因編輯技術(shù)特異性敲除母源Yap后，胚胎表現(xiàn)出二細(xì)胞階段的延長(zhǎng)并且胚胎發(fā)育至四細(xì)胞的速度明顯減慢［5］；合子阻滯因子1（zygotearrest 1，Zar1）缺失的雌性小鼠無(wú)法正常懷孕，同時(shí)Zar1缺失的胚胎大多阻滯在一細(xì)胞期，也有部分阻滯在二細(xì)胞時(shí)期［6］；熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，Hsf1）是較早發(fā)現(xiàn)的母源效應(yīng)基因，母源Hsf1 的缺失同樣會(huì)導(dǎo)致雌性不孕及合子期胚胎發(fā)育的停滯［7］。因此，揭示關(guān)鍵母源因子的功能對(duì)研究和解釋雌性不孕及早期胚胎發(fā)育障礙至關(guān)重要。

鋅指蛋白212（Zinc finger protein 212，Zfp212）是Krüppel 相關(guān)盒型鋅指蛋白（Krüppel-associated box domain zinc finger protein，KZFP）家族的一員，其N(xiāo) 端包含一個(gè)Krüppel 相關(guān)盒（Krüppel-associated box，KRAB），C 端排列著4 個(gè)半胱氨酸-組氨酸鋅指結(jié)構(gòu)域。研究報(bào)道，KZFP 參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡和癌癥等多種生物學(xué)過(guò)程［8］，但KZFP最為人們所熟知的作用是在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中募集KRAB-相關(guān)蛋白1（KRAB-associated protein 1，KAP1）［9］。KAP1 是小鼠和人類(lèi)的KRAB 結(jié)合輔因子，它與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1（SET domain，bifurcated 1）、異染色質(zhì)蛋白1（heterochromatin protein 1，HP-1）、核小體重塑和脫乙酰（nucleosome remodeling and deacetylase，NuRD）復(fù)合物和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1、3A、3B共同組成沉默復(fù)合體［10］。因此，KZFP 通過(guò)KAP1 介導(dǎo)的異染色質(zhì)形成和DNA 甲基化抑制轉(zhuǎn)錄并在胚胎表觀遺傳重編程過(guò)程中發(fā)揮作用［9］。

最近，Zfp212 被證明與KAP1 之間存在相互作用［11］，本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建Zfp212 基因敲除小鼠，并對(duì)雌性小鼠生殖表型進(jìn)行了分析，探索Zfp212 是否具有母源效應(yīng)，以及其在雌性生育力建立過(guò)程中是否發(fā)揮重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6 小鼠飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下，飼養(yǎng)室溫度20～22 ℃，濕度50%～70%，光照時(shí)間遵循小鼠的晝夜節(jié)律。所有小鼠實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)（批準(zhǔn)編號(hào)：IACUC-1908013-1）批準(zhǔn)。

Rapid Taq master mix、pCE2 TA/Blunt-Zero vector、HiScript ⅡQ RT SuperMix、SYBR Qpcr Master Mix（南京Vazyme 公司），AxyPrep PCR Cleanup Kit（Axgen 公司，美國(guó)），孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（浙江三生藥業(yè)），人輸卵管液（human tubal fluid，HTF）（江蘇易核公司），EmbryoMax Advanced KSOM Embryo Medium（KSOM）、二氟化樹(shù)脂膜（polyvinylidene fluoride，PVDF membrane）（Millipore 公司，美國(guó)），RIPA lysis buffer、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（康為世紀(jì)公司），化學(xué)發(fā)光試劑盒（杭州弗德生物公司），多聚甲醛（PFA）、伊紅（Sigma 公司，美國(guó)），TRIzol Reagent（Invitrogen 公司，美國(guó)），蘇木素（武漢Servicebio 公司），Zfp212抗體（賽默飛世爾公司），β-TUBULIN 抗體（Abclonal 公司，美國(guó)），ACTIN 抗體（Santa Cruz 公司，美國(guó)），熒光二抗Alexa FluorTM555 donkey antirabbit IgG（Invitrogen 公司，美國(guó)），HRP 標(biāo)記的Goat anti-Mouse IgG（H+L）secondary antibody、HRP 標(biāo)記的Goat anti-Rabbit IgG（H+L）secondary antibody，（Invitrogen公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 Zfp212基因敲除小鼠模型的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Zfp212基因敲除小鼠［12］，Cas9 mRNA 由南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室沈彬教授課題組提供。sgRNA 設(shè)計(jì)在Zfp212基因的2號(hào)外顯子上，兩條sgRNA序列如下：5′-GCCCCTCCAGGCTCTGCAGTCGG-3′和5′-TGACTTCGAGAAGACAGCTGTGG-3′。將Cas9 mRNA和sgRNA同時(shí)注射到受精卵中，然后將受精卵移植到假孕小鼠子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，獲得F0代小鼠。

1.2.2 小鼠基因型鑒定及Zfp212 純合型缺失小鼠的獲得

從基因編輯小鼠腳趾中提取DNA，利用Rapid Taq master mix、引物、雙蒸水配制PCR 體系，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化并克隆到pCE2 TA/Blunt-Zero 載體中，然后進(jìn)行Sanger 測(cè)序，使用Vector NTI（11.5版）比對(duì)測(cè)序結(jié)果，確定其基因型以篩選出符合要求的基因缺失小鼠。將選定的F0代小鼠與野生型小鼠雜交以純化背景，然后將得到的F1 代小鼠雜交，最終獲得Zfp212 基因2 號(hào)外顯子62 對(duì)堿基對(duì)缺失的純合型F2代小鼠。PCR所需Zfp212 基因引物序列如下：正向引物5′-CACTGGCCTTGTCTCCTCAATC-3′、反向引物5′-CAGACGAAGGACCCAGAAGTT-3′。

1.2.3 MⅡ期卵母細(xì)胞的收集

向8～10 周齡的雌性小鼠腹腔注射5 U PMSG，46～48 h后注射5 U HCG，進(jìn)行超數(shù)排卵。HCG注射后13～16 h 將膨大的輸卵管壺腹剪下，在體式顯微鏡下使用1 mL注射器針頭戳破膨大部分，釋放出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocytes complex，COC），并在37 ℃下用0.5 mg/mL 透明質(zhì)酸酶消化COC以釋放卵母細(xì)胞，每組收取50枚MⅡ期卵母細(xì)胞蛋白，用于Zfp212蛋白表達(dá)模式驗(yàn)證及Zfp212蛋白敲除效率驗(yàn)證，每組收取20枚用于提取RNA。

1.2.4 體外受精和胚胎培養(yǎng)

體外受精實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好獲能皿、受精皿和培養(yǎng)皿，放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過(guò)夜。雌性小鼠準(zhǔn)備工作如上所述，取卵前1 h從成年雄性小鼠附睪尾收集精子并在人輸卵管液（human tubal fluid，HTF）中獲能1 h，然后將獲能精子加入已撥入COC的受精滴中，孵育4～5 h后，將受精卵在KSOM培養(yǎng)液中洗去多余精子并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期。

1.2.5 生發(fā)泡期卵母細(xì)胞和各時(shí)期胚胎的收集

取3～4 周齡的小鼠卵巢，在體式顯微鏡下將卵巢組織完整地從包膜中剝離出，并用l mL注射器針頭扎破透亮的大卵泡，使COC 溢出至培養(yǎng)液中，通過(guò)反復(fù)吹吸去掉顆粒細(xì)胞，得到干凈裸露的生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）期卵母細(xì)胞。一細(xì)胞期、二細(xì)胞期、四細(xì)胞期、桑葚胚期以及囊胚期的胚胎分別在受精后12～13 h、24～25 h、46～48 h、71～72 h和96～98 h收取，卵母細(xì)胞或胚胎樣本每組收取50 枚，用于蛋白表達(dá)模式驗(yàn)證，每組20枚用于提取RNA。

通過(guò)各個(gè)維度特征的比較分析，我們大致勾勒出一幅《政府工作報(bào)告》英譯本在語(yǔ)體特征上的框架:高信息性，高指代性、高說(shuō)服性，低敘事性，書(shū)面色彩強(qiáng)烈，在維度1、2、3上更接近于政府文件，而只在維度五“抽象性”上更接近備稿演講，文本理解和閱讀難度較高。而作為對(duì)等文獻(xiàn)的《美國(guó)國(guó)情咨文》書(shū)面色彩較弱，只在維度2敘事性上接近政府文件，在維度1、3、5更近似于備稿演講，閱讀和理解難度較低，聽(tīng)眾和讀者便于抓住主要信息。兩篇文獻(xiàn)除了在抽象性維度上較為接近以外，其余四個(gè)維度的差異都較為明顯。彌補(bǔ)了前人試圖僅依靠詞匯層面揭示二者文體差異的不足。

1.2.6 Western blot檢測(cè)

按上述時(shí)間點(diǎn)收集所需數(shù)目的卵母細(xì)胞或胚胎，加入8 μL添加了1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的增強(qiáng)型RIPA裂解液，2 μL 5×loading buffer，100 ℃沸水浴5 min，提取卵母細(xì)胞和胚胎蛋白。在200 V 電壓下使用10%的SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，在300 mA 條件下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，使用5%脫脂牛奶在室溫下將膜封閉2 h后，進(jìn)行一抗（Zfp212 抗體稀釋比為1∶1 000，Actin、Tubulin 抗體稀釋比為1∶10 000）孵育，4 ℃孵育過(guò)夜后用TBST洗膜10 min×3 次，相應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h后重復(fù)上述洗膜步驟，然后滴加超敏型顯影液，利用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光觀察。

1.2.7 免疫熒光（immunofluorescence staining，IF）

卵母細(xì)胞或胚胎在4%多聚甲醛中室溫固定30 min，然后在0.5%Triton X-100中透膜30 min，1%牛血清白蛋白中室溫封閉1 h，最后在4 ℃條件下孵育一抗（Zfp212 稀釋比為1∶200）過(guò)夜。用PBS 洗滌3 次洗去多余一抗，然后將卵母細(xì)胞或胚胎在相應(yīng)的二抗（稀釋比1∶200）中室溫孵育1 h，PBS洗滌3次后用Hoechst 33342（稀釋比1∶500）染核10 min，洗滌、封片并通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡成像。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）

用TRIzol 提取組織、卵母細(xì)胞或胚胎中的總RNA，并使用HiScript ⅡQ RT SuperMix 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，NanoDrop 2000C 測(cè)定cDNA 濃度后，將cDNA 稀釋至100 ng/μL，使用ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)基因表達(dá)情況。根據(jù)公式2-△△CT計(jì)算Zfp212mRNA表達(dá)含量。2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Zfp212表達(dá)模式。RTqPCR擴(kuò)增引物包含以下序列：Zfp212正向引物：5′-AGAAGCTGGCTGACTTCGAG-3′，反向引物：5′-GCAGACGAAGGACCCAGAAG-3′；18s正向引物：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，反向引物5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。

1.2.9 組織學(xué)分析

8 周小鼠的卵巢組織用4%的多聚甲醛室溫固定4～6 h，然后轉(zhuǎn)移到梯度乙醇溶液中脫水，最后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟包埋的卵巢塊切成5 μm 的連續(xù)切片，37 ℃溫水中展片，撈起展好的切片置于載玻片上，脫蠟后進(jìn)行HE 染色。制片完成后進(jìn)行卵巢形態(tài)學(xué)分析和卵泡計(jì)數(shù)，為了避免對(duì)同一卵泡進(jìn)行多次計(jì)數(shù)，采取每隔兩張取一張卵巢切片進(jìn)行計(jì)數(shù)的方式，除原始卵泡外，只計(jì)數(shù)具有可見(jiàn)卵母細(xì)胞核的卵泡。原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇前卵泡和竇卵泡區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)如下：原始卵泡中含有1 個(gè)卵母細(xì)胞，被鱗狀顆粒細(xì)胞所包圍；初級(jí)卵泡包含1 層立方型顆粒細(xì)胞；次級(jí)卵泡有1 層以上顆粒細(xì)胞，無(wú)可見(jiàn)竇；早期的竇狀卵泡一般只有1到2個(gè)小竇腔，而竇狀卵泡具有1個(gè)大竇腔，且均被多層顆粒細(xì)胞包圍。卵泡計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.10 生育力測(cè)試

3只成年Zfp212純合型缺失的雌性小鼠與生育力正常的Zfp212 雜合型缺失雄性小鼠交配6 個(gè)月，同時(shí)將3只Zfp212雜合型缺失雌性小鼠與Zfp212雜合型缺失雄性小鼠作為對(duì)照組進(jìn)行配繁，記錄并統(tǒng)計(jì)每窩幼崽的數(shù)量和出生日期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 8.0.2 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，除Zfp212 mRNA表達(dá)模式數(shù)據(jù)為均數(shù)外，其他定量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±Sx）表示，使用t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zfp212在卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)模式

為觀察Zfp212的表達(dá)模式，提取小鼠不同組織和細(xì)胞的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，調(diào)整cDNA 濃度至100 ng/μL后進(jìn)行RT-qPCR。結(jié)果顯示，Zfp212在生殖系統(tǒng)中高表達(dá)，特別是在雌性小鼠的卵巢和生殖細(xì)胞中。為了確定Zfp212 在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)情況，在生殖細(xì)胞及胚胎發(fā)育的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收樣并進(jìn)行RT-qRCR 定量，結(jié)果顯示Zfp212 mRNA 在GV 期卵母細(xì)胞、MⅡ期卵母細(xì)胞和受精卵中均高表達(dá)，而在隨后的二細(xì)胞期至囊胚階段表達(dá)明顯下降（圖1A）；Western blot 結(jié)果顯示Zfp212 蛋白主要在MⅡ期卵母細(xì)胞中高表達(dá)（圖1B）；免疫熒光染色分析了Zfp212 在卵母細(xì)胞及各時(shí)期胚胎中的定位，結(jié)果顯示，GV期卵母細(xì)胞中Zfp212 蛋白主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞中Zfp212 主要定位于紡錘體上，而在受精后至四細(xì)胞期幾乎觀察不到Zfp212 蛋白熒光定位，直至八細(xì)胞期，Zfp212蛋白重新表達(dá)并定位在胚胎的細(xì)胞質(zhì)中（圖1C、D）。綜上所述，發(fā)現(xiàn)Zfp212的表達(dá)模式符合母源基因表達(dá)特性，因此推測(cè)Zfp212可能作為母源因子在卵母細(xì)胞成熟或早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

2.2 構(gòu)建Zfp212基因敲除小鼠

為進(jìn)一步探究Zfp212 在體內(nèi)是否發(fā)揮作用及其作用機(jī)制，以小鼠作為研究模型，借助CRISPR/Cas9 技術(shù)［13-14］構(gòu)建了Zfp212 基因敲除小鼠（圖2A、B）。利用核酸凝膠電泳和Sanger 測(cè)序方法鑒定Zfp212敲除小鼠的基因型（圖2C），并提取了Zfp212純合型缺失（Zfp212-/-）小鼠的卵母細(xì)胞蛋白，通過(guò)Western blot 檢測(cè)ZFP212 蛋白的敲除效率（圖2D），結(jié)果顯示ZFP212 蛋白在Zfp212-/-小鼠中被成功清除，Zfp212基因敲除小鼠構(gòu)建成功。

圖2 Zfp212基因敲除小鼠模型的構(gòu)建Figure 2 Generation of Zfp212 knockout mice

2.3 Zfp212-/-雌性小鼠生殖表型分析

2.3.1 卵巢及卵泡發(fā)育情況

為觀察Zfp212 基因敲除雌性小鼠的卵泡發(fā)育情況，收取8 周齡雌性小鼠的卵巢進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和卵泡計(jì)數(shù)。首先，通過(guò)形態(tài)學(xué)分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)8周齡Zfp212-/-雌性小鼠與對(duì)照組小鼠的卵巢形態(tài)、大小相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=3，圖3A、B）；通過(guò)卵巢切片和HE 染色分析小鼠卵泡發(fā)育情況，卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果顯示Zfp212-/-小鼠各時(shí)期卵泡（原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、早竇和竇狀卵泡）數(shù)量與對(duì)照組小鼠卵泡數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=3，圖3C、D）。由此證實(shí)，Zfp212基因敲除不影響雌性小鼠的卵泡發(fā)育。

2.3.2 卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育情況

為進(jìn)一步觀察Zfp212-/-雌性小鼠的卵母細(xì)胞能否正常成熟并排卵，利用8 周齡的雌性小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠均可排出成熟的卵母細(xì)胞（MⅡ期卵母細(xì)胞），統(tǒng)計(jì)超排卵的數(shù)量后發(fā)現(xiàn)，Zfp212-/-小鼠的排卵數(shù)量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=4，圖3E）；對(duì)排出的MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精和植入前胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而觀察其受精和早期胚胎發(fā)育情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，Zfp212 基因缺失不影響卵母細(xì)胞正常受精及植入前胚胎發(fā)育（P＞0.05，n=3，圖4A、B）。綜上所述，Zfp212 基因敲除不影響小鼠的卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育。

圖3 Zfp212 敲除雌性小鼠生殖表型分析Figure 3 Analysis of the reproductive phenotype of Zfp212 knockout female mice

2.3.3 Zfp212-/-小鼠生育能力測(cè)試

將3 只8 周齡的Zfp212-/-雌性小鼠配繁6 個(gè)月，并取3 只Zfp212+/-雌性小鼠作為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)其生仔情況。結(jié)果顯示Zfp212-/-組與對(duì)照組的每窩產(chǎn)仔數(shù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，n=3，圖4C）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Zfp212 敲除未影響雌性小鼠的生育能力。

圖4 Zfp212敲除小鼠植入前胚胎發(fā)育及生育力測(cè)試Figure 4 Development of preimplantation embryos and fertility test in Zfp212 knockout mice

3 討論

母源因子被證實(shí)在受精、表觀遺傳重編程、減數(shù)分裂到有絲分裂的過(guò)渡和早期胚胎發(fā)育等生物學(xué)事件中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3，15］。研究發(fā)現(xiàn)，部分KZFP 作為母源因子在早期胚胎發(fā)育和雌性生育力建立過(guò)程中扮演重要角色。哺乳動(dòng)物母源效應(yīng)基因鋅指蛋白57（Zinc finger protein 57，Zfp57）是KZFP 家族成員之一，它通過(guò)識(shí)別、結(jié)合印記控制區(qū)（imprinting control regions，ICR），并招募KAP1 和其他的染色質(zhì)誘導(dǎo)蛋白，驅(qū)動(dòng)ICR 的甲基化［16］，Zfp57缺失后導(dǎo)致多個(gè)ICR的DNA甲基化缺失，最終導(dǎo)致妊娠中期的胚胎死亡［17-18］；但Zfp57 缺失后一些位點(diǎn)的甲基化水平并未受到影響，進(jìn)一步探索后，研究人員發(fā)現(xiàn)另一KZFP——鋅指蛋白445（Zinc finger protein 445，Zfp445），其與Zfp57 在維持部分ICR 甲基化中起協(xié)同作用，在Zfp57 缺失的情況下，Zfp445是維持這部分ICR 甲基化所必需的［19］。鋅指蛋白708（Zinc finger protein 708，Zfp708）是一個(gè)母源性KZFP，其通過(guò)將抑制性KAP1 復(fù)合物募集到逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RMER19B上，引起區(qū)域異染色質(zhì)形成，雖然Zfp708敲除小鼠的生育能力未受影響，但卻無(wú)法維持Zfp708靶位點(diǎn)的甲基化水平，并且會(huì)產(chǎn)生RMER19B相鄰基因的激活現(xiàn)象［10］。此外，KAP1 在胚胎發(fā)育及雌性生育力建立中也發(fā)揮著重要作用，母源KAP1 的缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的表觀遺傳變異，從而導(dǎo)致胚胎致死［20］，且已有研究表明，母源性表達(dá)的KZFP 可能是KAP1 的候選靶蛋白。因此本研究探究了以前未有過(guò)功能表征的KZFP——Zfp212，基于其母源表達(dá)模式以及既往已有的其與KAP1相互作用的研究報(bào)道，推測(cè)Zfp212 可能與KAP1 形成KZFP/KAP1復(fù)合體，在卵母細(xì)胞到早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮特異性功能。

本研究首先通過(guò)RT-qPCR、Western blot和IF實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Zfp212在多組織或細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Zfp212 在生殖系統(tǒng)和雌性生殖細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，且其表達(dá)模式符合母源調(diào)控因子表達(dá)特征，據(jù)此，推測(cè)Zfp212 可能作為母源蛋白，在卵母細(xì)胞成熟或早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為探究其體內(nèi)功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對(duì)Zfp212基因的2 號(hào)外顯子設(shè)計(jì)sgRNA，并利用DNA 測(cè)序和Western blot實(shí)驗(yàn)在不同分子水平上驗(yàn)證敲除效率，結(jié)果顯示成功獲得Zfp212 敲除小鼠。Zfp212-/-小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，同時(shí)，本研究對(duì)Zfp212-/-雌性小鼠的卵巢重量和形態(tài)進(jìn)行觀察測(cè)量，結(jié)果顯示其與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異；隨后觀察了對(duì)雌性生育力至關(guān)重要的幾個(gè)生物學(xué)事件，包括卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和排卵、受精及早期胚胎發(fā)育，一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在Zfp212-/-雌性小鼠體內(nèi)，這些關(guān)鍵的生物學(xué)事件均可正常發(fā)生，并且與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異；生育力測(cè)試結(jié)果顯示Zfp212-/-雌性小鼠可正常生育后代，并且產(chǎn)仔數(shù)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。因此得出結(jié)論，Zfp212 缺失不影響雌性小鼠的生育能力。

雖然Zfp212 在雌性生殖系統(tǒng)中高表達(dá)，但Zfp212 敲除小鼠呈現(xiàn)出可育表型，可能的解釋是Zfp212 是一個(gè)功能冗余基因，基因冗余意味著兩個(gè)或多個(gè)基因執(zhí)行相同的功能，并且這些基因中的某個(gè)基因失活對(duì)生物表型影響很小或者沒(méi)有影響。比如，NLR 家族pyrin 結(jié)構(gòu)域蛋白9a/b/c（NLR family pyrin domain containing 9a/b/c，Nlrp9a/b/c）在卵母細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，在體外培養(yǎng)條件下，Nlrp9a/b/c 同時(shí)突變后胚胎阻滯在二細(xì)胞階段，并且伴隨細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分裂，但任意兩個(gè)Nlrp9基因突變不會(huì)發(fā)生二細(xì)胞阻滯現(xiàn)象，說(shuō)明Nlrp9a/b/c間存在功能冗余［21］。由于KZFP 家族成員數(shù)量龐大，因此推測(cè)其家族成員間存在功能冗余；另一方面，如前所述，Zfp708缺失雖不影響雌性小鼠的生育能力，但其與KAP1 協(xié)同調(diào)節(jié)的表觀遺傳修飾受到嚴(yán)重影響［10］，已有研究表明在體細(xì)胞中Zfp212與KAP1之間也存在相互作用［11］，但目前尚未在卵細(xì)胞中驗(yàn)證Zfp212與KAP1是否相互作用，以及是否可能協(xié)同調(diào)控表觀遺傳修飾。因此，需要進(jìn)一步探索Zfp212 與KAP1 是否存在相互作用，及其對(duì)表觀遺傳修飾的影響，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組分析等手段，探索Zfp212 缺失是否導(dǎo)致其他KZFP 家族成員代償性表達(dá)，或與其他KZFP 協(xié)同作用，并進(jìn)一步探索是否存在其他功能未被揭示的KZFP 在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用。