仲逢鈺,秦振英,李 婧,田 甜,牟雨虹,田慧琴,胡幼芳
南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒童保健科,江蘇 南京 210029
世界衛(wèi)生組織報道,自1975 年以來,全球肥胖人數(shù)幾乎增加了兩倍,現(xiàn)共有6 000 萬5 歲以下兒童患上肥胖癥,肥胖已成為一個嚴重的公共健康問題[1]。肥胖以脂肪大量堆積為特征,并可導致多種代謝紊亂相關(guān)疾病的發(fā)生,如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾?。?-3]。脂肪組織不僅是儲能器官,為人體的生命活動提供能量,也是人體重要的內(nèi)分泌器官,可分泌多種細胞因子,具有重要生理功能[4-5]。然而,由于能量攝入與消耗的不平衡,大量能量以甘油三酯的形式儲存,脂肪組織迅速膨脹,脂肪組織的擴張將導致炎性細胞因子分泌增加,并減少瘦素和脂聯(lián)素等抗炎蛋白的分泌,從而導致代謝紊亂[6-7]。因此,深入研究脂肪組織的生成代謝對降低肥胖發(fā)生率具有重要意義。
脂肪生成是一個復雜的過程,與多種轉(zhuǎn)錄因子的動態(tài)表達有關(guān)。前體脂肪細胞的增殖和分化增加成熟脂肪細胞的數(shù)量,促進了甘油三酯的儲存、代謝,并產(chǎn)生脂肪因子[8]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA(18~24核苷酸),通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)特異性結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控基因表達[9]。一些研究表明,miRNA 可能和脂肪細胞的分化增殖發(fā)生相關(guān)。例如,Chen等[10]發(fā)現(xiàn)miR-146b是人內(nèi)臟前脂肪細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)因子,其表達在人體內(nèi)發(fā)生改變。miR-130b 可以靶向過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)抑制豬脂肪沉積[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-484 在肥胖婦女或兒童的脂肪組織中差異表達[9,12],同時其表達與組織缺血再灌注損傷[13]、宮頸癌腫瘤發(fā)生[14]、肝硬化[15]等有關(guān)。然而,miR-484在肥胖中的作用仍不清楚。本研究通過在人前體脂肪細胞(human preadipocytes,HPA)中過表達及沉默miR-484,研究其對HPA細胞增殖及成脂分化的影響,在細胞層面揭示miR-484對肥胖的作用,并探討了其下游作用的可能靶基因,以期為肥胖的防治提供一個新靶點。
1.2.1 細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
培養(yǎng)板中按1×105個/mL接種HPA(Science Cell公司,美國),在37 ℃、5%CO2孵箱中,以含5%胎牛血清的人脂肪細胞培養(yǎng)基培養(yǎng),每2 d換液1次,待細胞貼壁生長至完全融合并接觸抑制2 d后(第0天)開始誘導分化。具體步驟為:培養(yǎng)基換用DMEM 高糖培養(yǎng)基,其中含0.5 mmol/L MIX、1 μmol/L地塞米松、5 μg/mL胰島素和1 μmol/L羅格列酮,培養(yǎng)4 d。隨后分化培養(yǎng)基中撤去MIX、地塞米松、羅格列酮,使DMEM高糖培養(yǎng)基中只含有5 μg/mL胰島素。后每3 d 換液1 次,直至第15 天,約85%以上的細胞已分化為成熟人脂肪細胞。為了評價miR-484對HPA增殖和分化的影響,采用Lipofectamine 3000對細胞轉(zhuǎn)染miR-484 mimic、miR-484 inhibitor、MAPK8 過表達質(zhì)粒及其陰性對照。
1.2.2 CCK-8實驗
為了研究HPA的增殖能力,使用CCK-8檢測試劑盒在0 h、24 h、48 h 這3 個不同的時間點進行檢測。使用10 μL CCK-8 溶液處理接種在96 孔板中(5×103個/mL)的脂肪細胞,孵育細胞2 h 后,使用分光光度儀測定其450 nm處吸光度值。
1.2.3 油紅O染色
油紅O 染色在室溫下進行,取誘導分化成熟的人脂肪細胞(第15 天),用PBS 洗滌細胞3 次,后在10%多聚甲醛中固定1 h,吸取出固定液后晾干。油紅O 溶解于異丙醇中,配成3 mg/mL的染液并過濾,隨后加入晾干的細胞中染色1 h。最后,用PBS輕輕洗滌細胞,倒置顯微鏡觀察,鏡下脂滴應成亮紅色。
1.2.4 細胞甘油三酯含量測定
細胞接種于6 孔板中,取分化成熟的人脂肪細胞(第15 天),PBS 輕柔洗滌細胞1 次后用胰酶消化細胞,收集細胞于離心管中,根據(jù)甘油三酯測定試劑盒說明書,加入100 μL裂解液,室溫裂解10 min,留取20 μL 裂解液進行BCA 法蛋白定量,70 μL 裂解液70 ℃加熱10 min后離心取上清,使用分光光度儀在510 nm處測量細胞裂解物中甘油三酯的含量,測定結(jié)果用總蛋白濃度校準。
1.2.5 靶基因測定與驗證
(2)輔助材料成本。報廢的動力電池需要用酸、堿、有機溶劑、沉淀劑等進行處理,回收的工藝不同以及最后產(chǎn)品的不同,所使用的輔助材料也有所不同。
利用在線數(shù)據(jù)庫Targetscan7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)對miR-484 的靶基因及潛在的結(jié)合位點進行了預測。使用DAVID 6.7在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(Gene Ontology,GO)分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。為了驗證結(jié)合位點,構(gòu)建了熒光素酶報告質(zhì)粒MAPK8 的野生型和突變型。將293T 細胞接種到24 孔板中,以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。當細胞密度達到70%時,將野生型或突變型質(zhì)粒與miR-484 mimic 及miR-484 mimic NC 共轉(zhuǎn)染到293T 細胞中。24 h 后使用雙熒光素酶報告分析試劑盒測量熒光素酶活性。
1.2.6 RT-qPCR檢測
使用TRIzol法提取細胞的總RNA,使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行mRNA 和miRNA 的逆轉(zhuǎn)錄,用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)進行定量實時聚合酶鏈反應。使用2-ΔΔCT法計算mRNA和miRNA的相對表達水平。β-actin用作mRNA的內(nèi)部標準化對照,U6用作miRNA的內(nèi)部標準化對照。qRT-PCR檢測中使用的引物序列見表1。
表1 實時定量PCR目的基因的引物Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR
1.2.7 Western blot實驗
用RIPA法提取細胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液,將蛋白樣品的濃度定為20 ng/mL,在100 ℃金屬浴煮沸10 min 變性。采用10%SDS/PAGE 凝膠和聚偏氟乙烯膜分離及轉(zhuǎn)移蛋白,將膜在室溫下用5%牛奶封閉1 h后,與適當稀釋的特異性抗體(MAPK8、β-actin)一起4 ℃孵育過夜,TBST洗滌膜3 次,然后加入二抗,在搖床中孵育1 h。最后用超敏ECL化學發(fā)光試劑檢測曝光蛋白條帶。
采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標準差()表示,3組獨立樣本之間的差異采用重復測量方差分析檢驗,當3 組獨立樣本間的差異有統(tǒng)計學意義時,SNK 法進行組間兩兩比較。采用Graphpad Prism 繪制直條圖、復式直條圖、線圖等。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
為了驗證HPA 分化過程中miR-484 的表達情況,分別取分化第0天、第4天、第8天、第15天的細胞,使用RT-qPCR 技術(shù)檢測,結(jié)果與未分化的細胞(第0 天)相比,隨著分化的進行,miR-484 表達量逐漸降低(P<0.05),表明miR-484可能參與HPA的分化(圖1A)。此外,為了驗證miR-484過表達體系的建立,在HPA中轉(zhuǎn)染了miR-484及其空白質(zhì)粒,通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)miR-484表達較對照組及mimic NC組增高(P<0.05,圖1B)。
圖1 miR-484在HPA分化過程中的表達及其過表達驗證Figure 1 Relative expression of miR-484 in HPA and overexpression validation of miR-484
為了進一步了解過表達miR-484對脂肪生成的作用,將miR-484 mimic及miR-484 mimic NC分別轉(zhuǎn)染至HPA 中。CCK-8 實驗檢測轉(zhuǎn)染后0 h、24 h 及48 h HPA的增殖能力,發(fā)現(xiàn)與對照組及mimic NC組相比,miR-484 mimic組在24 h及48 h的吸光度值降低(P<0.05,圖2A)。同時對細胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin D3 和CDK4 的mRNA 相對表達量進行了檢測,RT-qPCR 實驗發(fā)現(xiàn)miR-484 mimic 組的細胞周期相關(guān)基因表達量均減少(P<0.05,圖2B),由此可見,過表達miR-484可以抑制HPA的增殖。
為了研究miR-484 對HPA 成脂分化的影響,在HPA中過表達miR-484后,對分化第15天的成熟人脂肪細胞進行油紅O染色,鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與對照組及mimic NC 組相比,miR-484 mimic 組脂肪細胞脂滴數(shù)量及體積明顯減少(圖2C),也對脂肪分化相關(guān)基因PPAR γ、C/EBP α和FABP4 的mRNA 相對表達量進行了檢測,RT-qPCR 實驗發(fā)現(xiàn)miR-484 mimic組的脂肪分化相關(guān)基因表達量均減少(P<0.05,圖2D)。同時,甘油三酯定量測定發(fā)現(xiàn)與對照組及mimic NC組相比,miR-484 mimic組的甘油三酯含量減少(P<0.05,圖2E)。這表明過表達miR-484可以抑制HPA向成熟脂肪細胞分化。
圖2 miR-484抑制HPA的增殖分化Figure 2 miR-484 inhibits HPA proliferation and differentiation
為了進一步了解沉默miR-484對脂肪生成的作用,將miR-484 inhibitor及miR-484 inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染至HPA中。CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染后0 h、24 h及48 h HPA的增殖能力發(fā)現(xiàn),與對照組及inhibitor NC組相比,miR-484 inhibitor組在24 h及48 h的吸光值升高(P<0.05,圖3A)。同時對細胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin D3 和CDK4 的mRNA 相對表達量進行了檢測,RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)miR-484 inhibitor組的增殖相關(guān)基因表達量均升高(P<0.05,圖3B),由此可見,沉默miR-484可以促進HPA的增殖。
為了研究沉默miR-484 對HPA 成脂分化的影響,在脂肪細胞中沉默miR-484 后,對分化第15 天的成熟人脂肪細胞進行油紅O染色,鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與對照組及inhibitor NC組相比,miR-484 inhibitor組脂肪細胞脂滴數(shù)量及體積增加(圖3C),也對脂肪分化相關(guān)基因PPAR γ、C/EBP α和FABP 4的mRNA相對表達量進行了檢測,RT-qPCR 實驗發(fā)現(xiàn)miR-484 inhibitor 組的脂肪分化相關(guān)基因表達量均升高(P<0.05,圖3D)。同時甘油三酯定量測定發(fā)現(xiàn)與對照組及inhibitor NC組相比,miR-484 inhibitor組的甘油三酯含量增加(圖3E,P<0.05)。這表明沉默miR-484可以促進HPA向成熟脂肪細胞分化。
圖3 沉默miR-484促進HPA的增殖分化Figure 3 miR-484 inhibitor promotes HPA proliferation and differentiation
miRNA 可以與mRNA 的3′UTR 區(qū)結(jié)合沉默靶基因的表達,從而發(fā)揮重要的生物學功能。通過在線生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn),MAPK8 可作為miR-484的靶基因(圖4A)。為了進一步驗證miR-484 是否可與MAPK8 的3′UTR 區(qū)結(jié)合,本研究構(gòu)建了MAPK8 的突變型(MAPK MUT)與野生型(MAPK WT)質(zhì)粒,并進行了雙熒光素酶報告基因分析,結(jié)果表明,與mimic NC 組相比,miR-484 mimic 與MAPK8 WT 共轉(zhuǎn)組的相對熒光活性降低(圖4B,P<0.05),表明miR-484可與野生型MAPK8結(jié)合,由此可見,MAPK8可以與miR-484結(jié)合,可作為miR-484的靶基因。
圖4 miR-484 靶向作用于MAPK8Figure 4 miR-484 targets MAPK8
為了進一步驗證miR-48對其靶基因MAPK8的作用,本研究在脂肪細胞中過表達miR-484,qRT-PCR和蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示,與對照組及mimic NC 組相比,過表達miR-484 顯著下調(diào)了脂肪細胞中MAPK8 的mRNA 和 蛋 白 水 平(圖5,P<0.05)。這表明miR-484可以抑制MAPK8的表達。
圖5 miR-484抑制MAPK8的mRNA及其蛋白表達Figure 5 The expression of MAPK8 was down-regulated by miR-484
為了進一步研究miR-484 是否確實通過其靶標MAPK8 發(fā)揮功能,本研究將miR-484 mimic 與MAPK8 mimic 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進HPA 細胞。通過CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染后0 h、24 h及48 h HPA細胞的增殖能力發(fā)現(xiàn),與miR-484 mimic 相比,共轉(zhuǎn)染組24 h 及48 h 吸光度升高(P<0.05,圖6A)。對細胞周期相關(guān)基因Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4的mRNA相對表達量進行檢測,發(fā)現(xiàn)MAPK8 與miR-484 共轉(zhuǎn)部分逆轉(zhuǎn)了miR-484引起的相關(guān)基因表達量的下降(P<0.05,圖6B)。由此可見,MAPK8 可以逆轉(zhuǎn)miR-484抑制HPA細胞增殖的作用。對分化第15天的成熟人脂肪細胞進行油紅O染色,鏡下觀察發(fā)現(xiàn),MAPK8 逆轉(zhuǎn)了過表達miR-484 引起的脂肪細胞脂滴數(shù)量及體積的減少(圖6C),對脂肪分化相關(guān)基因PPAR γ、C/EBP α和FABP 4的mRNA 相對表達量進行檢測,發(fā)現(xiàn)MAPK8 可以逆轉(zhuǎn)miR-484 引起的脂肪分化相關(guān)基因表達量的下降(P<0.05,圖6D)。甘油三酯定量測定,發(fā)現(xiàn)MAPK8 逆轉(zhuǎn)了過表達miR-484 引起的甘油三酯含量下降(圖6E,P<0.05)。這表明過表達MAPK8 可以逆轉(zhuǎn)miR-484 抑制HPA增殖分化的作用。
圖6 過表達MAPK8部分挽救miR-484對HPA增殖分化的抑制作用Figure 6 Overexpression of MAPK8 partially rescued the function of miR-484 on HPA proliferation and differentiation
miRNA是調(diào)節(jié)基因表達的非編碼小RNA,在不同組織或器官中都發(fā)揮重要作用,它在脂肪組織中的主要功能是調(diào)節(jié)脂肪細胞的增殖、分化、代謝和內(nèi)分泌[16]。大量研究表明,肥胖與miRNA 的失調(diào)密切相關(guān),miRNA表達的改變可能導致控制一系列生物功能的基因表達模式的改變,包括炎癥、胰島素敏感性和脂肪生成[17]。miR-484差異表達于肥胖人群,但是miR-484 對脂肪細胞的生物學功能的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miR-484在HPA分化過程中表達逐漸降低,暗示了miR-484可能與肥胖發(fā)生相關(guān),同時也可能是脂肪分化與形成過程的重要靶點。
抑制脂肪組織的脂肪生成是肥胖發(fā)生過程中的一個中心事件,而脂肪細胞增殖和分化是脂肪組織中脂質(zhì)積累的基礎,可由多種因素調(diào)節(jié)[18]??刂浦镜姆只霸鲋晨梢砸种品逝趾头逝窒嚓P(guān)疾病的發(fā)生。本研究表明miR-484與HPA細胞的增殖及細胞周期調(diào)節(jié)基因Cyclin D1、Cyclin D3 和CDK4 表達成負相關(guān)。細胞周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin D3)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)被認為是真核生物中細胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,這是哺乳動物細胞中G1/S和G2/M轉(zhuǎn)變所必需的。Liu等[19]研究表明miR-484通過靶向CCL-18抑制胃癌細胞的增殖。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)lncRNA ZFAS1 通過沉默miR-484來促進結(jié)腸癌細胞的增殖。這些研究與本研究結(jié)果相一致。同時,本研究也發(fā)現(xiàn)miR-484 與脂肪分化基因PPARγ、C/EBPα 和FABP4 表達呈負相關(guān)。PPARγ和C/EBPα是脂肪分化過程中發(fā)揮核心作用的轉(zhuǎn)錄因子,F(xiàn)ABP4 促進脂肪酸增溶、運輸和新陳代謝。本研究進一步對HPA 進行了油紅O染色和甘油三酯檢測,發(fā)現(xiàn)miR-484 與脂滴生成負相關(guān)。因此認為miR-484 可以調(diào)控脂肪細胞的分化和增殖。
本研究中也對miR-484抑制HPA增殖與分化的機制進行了探討。miRNA 是內(nèi)源性小RNA,通過與蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA 配對來指導其轉(zhuǎn)錄后抑制,從而發(fā)揮重要的基因調(diào)節(jié)作用。通過在線生信分析發(fā)現(xiàn)MAPK8可能是miR-484的靶基因,并通過雙熒光素酶報告實驗確認了miR-484 與MAPK8具有相應的結(jié)合位點,同時過表達miR-484 可以抑制MAPK8的表達。MAPK8 是蛋白絲裂激酶家族的成員,充當多種生物化學信號的集成點,如胰島素信號通路,并且涉及各種細胞過程,例如增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育[21-22]。Osawa 等[23]發(fā)現(xiàn)MAPK8與胰島素抵抗相關(guān),MAPK8 活性在肥胖的胰島素抵抗小鼠中增加,而敲除MAPK8的小鼠顯示肥胖減少和胰島素敏感性提高。本研究過表達MAPK8,發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)過表達miR-484抑制HPA細胞增殖及分化的作用。結(jié)合既往研究及本研究結(jié)果,MAPK8可能是miR-484的靶基因。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)miR-484在HPA分化過程中低表達,并通過進一步的功能實驗,證實了miR-484抑制HPA 的增殖與分化,該作用可能是通過靶向MAPK8 來實現(xiàn)。本研究也存在一些缺點,例如miR-484 預測的相關(guān)靶基因較多,我們只關(guān)注了MAPK8,因為其屬于胰島素信號通路,且相關(guān)研究表明其與肥胖相關(guān),后期仍需采取轉(zhuǎn)錄組學等手段進一步研究相關(guān)機制。因此,本研究結(jié)果提示miR-484在肥胖中發(fā)揮關(guān)鍵作用,miR-484可能是肥胖診斷與治療的一個靶點。