司林杰，李娜娜，陳藝南，胡柳青*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科，2麻醉與圍術期醫(yī)學科，江蘇 南京 210029

圍術期神經認知障礙（perioperative neurocognitive disorders，PND）是手術后中樞神經系統(tǒng)的并發(fā)癥，表現(xiàn)為精神障礙、焦慮、性格改變和記憶障礙。許多風險因素與PND 相關，包括年齡、術前認知和情緒狀態(tài)［1］。冠狀動脈搭橋術后，早期認知功能障礙發(fā)生率高，達30%～60%，PND 嚴重影響患者術后的生活質量［2］。目前，PND 的診斷主要基于患者癥狀的描述、精神狀態(tài)的評估和臨床行為的評估，這些評估過程復雜且時間周期長［3］。雖然已經發(fā)現(xiàn)一些生物標志物與PND 相關，如S100 鈣結合蛋白B（S100B）和神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE），但與這些生物標志物相關的機制和基因仍有待闡明［4］。在特定條件下釋放的細胞外囊泡通過作用于外周和/或中樞受體，可能引發(fā)破壞性級聯(lián)反應，導致PND 的發(fā)展［5］。外泌體大小為40～150 nm，是包含mRNA和非編碼RNA的膜囊泡，從各種細胞中釋放出來，參與細胞間通信［6］。Zhang等［7］通過表達譜芯片發(fā)現(xiàn)了68 個lncRNA 和115 個mRNA 在PND 和非PND 患者中存在差異表達。隨后，Gao 等［8］研究表明hsa_circRNA_001145、hsa_circRNA_101138 和hsa_circRNA_061570 在PND 患 者中呈高表達，可能參與了PND 的發(fā)展。小RNA（microRNA，miRNA）是長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，通過轉錄后負調控基因表達來降低與生物學特性相關的蛋白質的表達，且許多研究已經證實miRNA參與神經炎癥并影響神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制［6］。多年來，本研究團隊致力于PND 領域的研究，并發(fā)表了多項研究成果［9］。前期，我們采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理肥大細胞P815后通過miRNA 表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)外泌體mmu-miR-409-3p 上調，并已在體內和體外實驗中證明高表達的外泌體miR-409-3p 促進神經炎癥［6］。大量研究證實神經炎癥在PND的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用［10］，然而，外泌體miR-409-3p 與PND的關系尚無報道。因此，本研究延續(xù)之前的結果，回歸臨床，從人群樣本的角度分析血漿外泌體miR-409-3p與冠狀動脈搭橋術PND的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2020年4月—2021年6月在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院接受冠狀動脈搭橋手術的患者，并收集所有患者的血漿樣本。排除標準：先前存在神經系統(tǒng)疾病，包括簡易智能量表（mini-mental state examination，MMSE）評分＜24 分；服用抗抑郁藥或抗焦慮藥病史；神經心理學評估困難。本研究經南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，并獲得了每位患者的書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 神經心理學評估

神經心理學測試主要用于評估注意力和執(zhí)行能力、記憶和學習能力、視覺空間意識和語言流暢性。該系列量表包括MMSE、顏色軌跡測試（color trail test，CTT）、數(shù)字跨度測試（digital span test，DST）、時鐘繪圖測試（clock drawing test，CDT）和語言流利度測試（verbal fluency test，VFT）。這些測試均由1位經驗豐富且對手術過程和血漿樣本結果不知情的研究人員分別在手術前1 d和手術后7 d進行評估和記錄。當至少有兩個量表|Z|大于1.96時，則認為發(fā)生了PND。具體方法參照之前的報道［11］。

1.2.2 患者數(shù)據(jù)收集

收集臨床特征和圍術期相關數(shù)據(jù)，包括患者的年齡、身高、體重、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、教育年限和手術時間。在麻醉前1 d 和手術后7 d 收集血液樣本（10 mL）。將所有樣本收集在抗凝管中，在4 ℃條件下300g離心5 min，然后1 200g和4 ℃條件下離心20 min，最后血漿保存在-80 ℃冰箱中直到進一步檢測分析。

1.2.3 外泌體的提取和鑒定

按照之前已發(fā)表文章中的方法，提取所有患者血漿中的外泌體［12］，隨后PBS 緩沖液（Biological Industries公司，以色列）洗滌沉淀，5%戊二醛固定，放入2%磷鎢酸溶液覆蓋的碳包銅網格中30 s。透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察外泌體的形態(tài)大小。粒徑分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）和ZetaView 8.04.02 軟件測量外泌體大小和濃度。在28.7 ℃pH 7.0的條件下使用110 nm 聚苯乙烯顆粒對ZetaView 系統(tǒng)進行校準。Western blot檢測CD63、TSG101及Calnexin水平。含有10 μg/mL磷酸酶抑制劑和100 μg/mL PMSF（上海Beyotime公司）的RIPA 試劑（上海Beyotime公司）提取總蛋白，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分離，隨后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。1 h 后，分別用抗CD63（ab134045，Abcam 公司，英國）、抗TSG101（ab30871，Abcam 公司，英國）、抗Calnexin（2679S，Cell Signaling Technology公司，美國）在4 ℃冰箱卵鳥育過夜。次日，PBS 洗滌3 次，每次5 min，分別與相應的二抗孵育2 h。采用增強化學發(fā)光（ECL）進行樣本檢測分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）

分別采用exoRNeasy Midi 試劑盒（Qiagen 公司，美國）和TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）提取血漿RNA 和血漿外泌體中的RNA，反轉錄為cDNA。ABI 7900 快速實時PCR 系統(tǒng)（ABI 公司，美國）進行檢測分析，引物序列為：miR-409-3p，上游5′-TGGTACTCGGAGAGAGGTTACCC-3′，下游5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′；GAPDH 對照，上游5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，下游5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′。PCR 條件為95 ℃5 min，94 ℃15 s，55 ℃30 s，40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均使用Stata 15.0 和Graphpad 8進行分析，正態(tài)分布的連續(xù)數(shù)據(jù)用均值±標準差（）表示，行t檢驗。計數(shù)資料均以例表示，行卡方檢驗。Logistic 回歸分析PND 的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者的臨床特征

本研究總共納入了76例患者，均完成了認知功能測試（表1），其中24例在冠狀動脈搭橋術患者圍手術期出現(xiàn)了PND，52例未發(fā)生PND?；颊邍中g期的臨床特征情況如表2所示。兩組在性別和BMI方面差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；然而，在年齡、手術時間及教育年限方面差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 認知功能測試評分Table 1 Cognitive function test scores（分，）

表1 認知功能測試評分Table 1 Cognitive function test scores（分，）

*：術后7 d，非PND vs.PND。

表2 患者臨床特征Table 2 Clinical characteristics of patients

2.2 外泌體的鑒定

首先，通過TEM 觀察外泌體為直徑40～150 nm的囊泡，并具有均勻的茶托樣形態(tài)（圖1A），大小分布由NTA 測量（圖1B）。為了進一步確定收集的囊泡是否為外泌體，通過Western blot檢測了外泌體標志物（CD63和TSG101）。如圖1C所示，在分離的外泌體部分觀察到CD63 和TSG101 表達水平升高，同時鈣連接蛋白Calnexin表達水平降低。上述結果證明，從患者血漿中提取的囊泡樣物質為外泌體。

圖1 外泌體的鑒定Figure 1 Identification of exosome

2.3 PND 患者血漿外泌體miR-409-3p 顯著升高

為了進一步揭示外泌體miR-409-3p 與PND 的關系，我們采用qRT-PCR檢測血漿外泌體miR-409-3p 的表達水平。PND 患者血漿外泌體miR-409-3p較非PND 患者血漿中顯著升高，差異倍數(shù)約為3 倍（P＜0.001，圖2）。隨后，采用Logistic 回歸分析PND 的影響因素，結果顯示：患者的年齡、手術時間和外泌體miR-409-3p 水平與PND 獨立相關（表3）。上述結果表明高表達的血漿外泌體miR-409-3p與PND發(fā)展密切相關，且可作為PND的新型分子標志物。

表3 Logistic回歸分析Table 3 Logistic regression analysis

圖2 外泌體miR-409-3p的表達水平Figure 2 The expression levels of exosomal miR-409-3p

3 討論

PND 是許多患者在外科手術后常見的并發(fā)癥之一，尤其是心臟手術后，不僅使患者術后康復周期延長，而且還嚴重影響了患者的生活質量［13］。因此，尋找預防和治療PND 的方法就顯得尤為重要。臨床上，PND難以準確診斷，有效的治療方法很少，這部分是因為PND的機制尚不清楚。目前，大量研究表明神經炎癥是PND 發(fā)展的關鍵因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞通過介導神經炎癥參與PND的發(fā)生發(fā)展，采用LPS處理肥大細胞P815后通過miRNA 表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)外泌體mmu-miR-409-3p 表達水平上調，并揭示了高表達的外泌體miR-409-3p可以促進神經炎癥［6］。然而，之前的研究都是在體內和體外實驗中論證的，尚無臨床層面的證實。為了促進認知功能障礙的臨床診斷，許多研究集中在腦脊液和外周血中發(fā)現(xiàn)的分子標志物［14］。然而，PND患者腰椎穿刺獲取腦脊液較為困難。因此，用于常規(guī)檢測認知功能障礙的血液生物標志物將更合適。本研究延續(xù)之前的結果，回歸臨床，從人群樣本的角度分析了人和鼠同源的外泌體miR-409-3p與冠狀動脈搭橋術PND的相關性，以尋找可作為PND生物標志物的血漿特異性miRNA。

外泌體是40～100 nm 的膜囊泡，從全身的多種組織、細胞中釋放出來，穩(wěn)定存在于唾液、血液、乳汁等體液中。外泌體含有多種物質，包括miRNA、lncRNA、circRNA、脂質和多種蛋白質等［6］。已有大量研究表明外泌體作為膜囊泡結構可以通過血腦屏障，進入大腦皮質、海馬組織等，進而影響神經系統(tǒng)，如外泌體介導中樞神經系統(tǒng)中神經元與星形膠質細胞通信中的作用［15］。谷氨酰胺酶1通過增強小膠質細胞激活和促炎性外泌體釋放來調節(jié)腦缺血后的神經炎癥［16］。CX3CL1/CX3CR1 軸通過促進蛛網膜下腔出血后外泌體miRNA-124 從神經元向小膠質細胞的遞送減輕早期腦損傷［17］。由于PND 的病理生理機制較為復雜，藥物的臨床療效較差，因此需要更全面綜合的方法來預防、診斷和治療PND。多年來，研究人員將工作重點放在蛋白質編碼基因和由這些基因編碼的蛋白質上［4］。隨著大量研究的不斷進展，發(fā)現(xiàn)只有一小部分遺傳物質編碼蛋白質，而大量的轉錄產物由功能多樣的非編碼RNA 產生，包括miRNA、lncRNA 和circRNA。近年來，越來越多的研究表明非編碼RNA參與不同疾病的發(fā)生發(fā)展。如miR-23b可以改善腦出血后的神經炎癥和發(fā)揮神經保護作用，促進神經功能恢復［18］。在口腔鱗狀細胞癌患者中，高表達的外泌體miR-182 與腫瘤浸潤深度密切相關［19］。同時，外泌體miRNA參與神經系統(tǒng)疾病的調控過程，如系統(tǒng)性外泌體miR-193b-3p 遞送減輕小鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷的神經炎癥［20］；來自miRNA-126修飾的內皮祖細胞的外泌體減輕腦損傷并促進中風后的功能恢復［21］。前期，我們從體外細胞實驗和動物水平已證實高表達的外泌體miR-409-3p 可以促進神經炎癥［6］；本研究進一步從臨床樣本中發(fā)現(xiàn)PND 患者血漿外泌體miR-409-3p 顯著升高，提示外泌體miR-409-3p與冠狀動脈搭橋術后PND過程有關，可能作為PND的分子標志物。然而，關于外泌體miR-409-3p是否與其他非心臟手術后PND有關，以及調控PND過程的具體分子機制仍需進一步探索。

由于PND涉及多方面的發(fā)生發(fā)展機制，未來的新型治療策略應從分子水平考慮疾病內在的調控失衡，為尋找新的分子靶標提供突破口。本課題組延續(xù)之前的研究，完善了從細胞、動物和臨床3個層面論證外泌體miR-409-3p 通過調控神經炎癥參與PND過程，從而為外泌體miR-409-3p作為PND診斷和治療的新型分子標志物提供了強有力的理論支持。單因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、手術時間、教育年限以及血漿外泌體miR-409-3p 的表達均與PND 的發(fā)生有關。一些研究證實年齡是PND 的一個獨立危險因素［22］。另外，為了排除年齡、手術時間以及血漿外泌體miR-409-3p表達等因素的相互干擾，進一步采用Logistic 回歸模型分析PND 獨立的預測因素，結果發(fā)現(xiàn)年齡、手術時間和外泌體miR-409-3p 表達均是PND 的獨立危險因素。

本研究也存在一些不足之處：①冠狀動脈搭橋手術患者臨床樣本數(shù)量較少，今后仍需要擴大樣本量進一步探索外泌體miR-409-3p 在PND 乃至其他神經系統(tǒng)疾病中的作用；②外泌體miR-409-3p調控PND具體的分子機制尚未探究。

綜上所述，我們完善前期研究結果，從臨床層面發(fā)現(xiàn)冠狀動脈搭橋術PND 患者血漿中外泌體miR-409-3p 呈高表達狀態(tài)，且與PND 發(fā)生獨立相關。外泌體miR-409-3p 可能是一種新型生物標志物，因此，本研究不僅為今后進一步研究其調控機制奠定了的基礎，也為PND領域的相關研究提供了新的思路。