殷玉蓮，孟 畑，馬麗娜，范奕偉，程一凡，仲芫沅，陳紅風(fēng)

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200023）

慢性難愈性瘡面是目前臨床上常見(jiàn)的問(wèn)題，也是外科臨床中的主要難題，從特征看，整體的病程久、病因復(fù)雜，同時(shí)治愈難度高，給患者帶來(lái)沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。慢性難愈性瘡面的遷延難愈使得患者生活質(zhì)量下降［1］，因此，研究其發(fā)病機(jī)制、潛在的重要作用靶點(diǎn)，尋求合適的治療方法是目前迫切的需求。研究表明，細(xì)菌感染是影響瘡面愈合的主要因素之一［2］，類型主要涵蓋了銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌等［3］。多重耐藥的超級(jí)細(xì)菌則導(dǎo)致組織鎖定在高炎癥狀態(tài)而難以愈合［4］，這給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)［5，6］。針對(duì)這一難題，九一丹作為中醫(yī)經(jīng)典外用藥物之一，具有顯著的祛腐生肌作用。九一丹的主要組分為升丹（氧化汞）和煅石膏（硫酸鈣），課題組前期研究發(fā)現(xiàn)九一丹可作用于非哺乳期乳腺炎患者局部瘡面組織中的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是一種常見(jiàn)的細(xì)胞群體，整體的功能狀態(tài)具備高異質(zhì)性，且可塑性強(qiáng)［7］，同時(shí)針對(duì)不同的局部微環(huán)境，巨噬細(xì)胞對(duì)應(yīng)的功能表型也存在很大差異，發(fā)揮各種不同的功能引導(dǎo)生理病理環(huán)節(jié)的發(fā)生。瘡面愈合過(guò)程中，巨噬細(xì)胞起初因?yàn)榀徝婢植垦装Y刺激，加速發(fā)揮吞噬功能，主動(dòng)清除壞死組織，同時(shí)清理入侵的病原微生物，待炎癥基本控制，巨噬細(xì)胞又極化為另一功能表型，可分泌多種細(xì)胞因子，這有利于后續(xù)的細(xì)胞修復(fù)，同時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，在血管與肉芽新生的過(guò)程中起促愈作用。據(jù)報(bào)道，巨噬細(xì)胞在感染小鼠清除金黃色葡萄球菌中起著重要作用［8］；而在瘡面愈合過(guò)程中局部巨噬細(xì)胞含量以及表型極化的不同將影響瘡面抗炎、修復(fù)的程序轉(zhuǎn)歸［9］。

本研究主要利用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）菌株感染皮損造模方法建立大鼠慢性難愈性瘡面模型，觀察九一丹有效組分對(duì)慢性難愈性瘡面的療效。通過(guò)對(duì)其瘡面組織的形態(tài)、M1 巨噬細(xì)胞表型特異性因子含量以及免疫熒光雙重染色測(cè)定，從九一丹影響巨噬細(xì)胞極化表型的改變，探討其治療MRSA 感染所致慢性難愈性瘡面的療效和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 大鼠共32 只，每只平均體重（200±20）g，全部購(gòu)買(mǎi)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，時(shí)間持續(xù)7 d，每2 只作為單位直接在2.5 cm 木屑?jí)|料的塑料籠內(nèi)部進(jìn)行飼養(yǎng)，同時(shí)確保小鼠的晝夜節(jié)律分別為12 h，飼養(yǎng)的過(guò)程中，其環(huán)境溫度設(shè)定為18～24 ℃，相對(duì)濕度維持在50%～70%。研究的整個(gè)過(guò)程均經(jīng)過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（PZSHUTCM191018006）。

1.2 藥物

實(shí)驗(yàn)所用的九一丹、升丹與煅石膏全部購(gòu)買(mǎi)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥制劑室（已完成相應(yīng)登記）。

1.3 關(guān)鍵試劑和儀器

白介素-6（interleukin-6，IL-6）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α），大鼠ELISA 試劑盒全部購(gòu)買(mǎi)自上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)分別對(duì)應(yīng)是JL21441 與JL13202 和JL20896；CD11C 抗體購(gòu)于Bioss，批號(hào)為Bs-2508R；F4/80 抗體、Goat anti-Rat 以及Goat anti-Rabbit 均購(gòu) 于 Abcam，批 號(hào) 為 Ab16911、Ab150157、Ab150080；關(guān)鍵儀器：組織切片機(jī)、TB-718 系列生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、RE52CS1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀與Neofuge 13R 低溫冷凍離心機(jī)等。

1.4 造模方法及分組

大鼠慢性難愈性瘡面造模參照文獻(xiàn)［10］，采取4%水合氯醛（1 mL/100 g）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，然后去除大鼠背部的毛發(fā)，使用直徑是2.5 cm 的圓形塑料環(huán)在大鼠頸與背部制造對(duì)應(yīng)的皮損范圍，然后選擇無(wú)菌剪刀與手術(shù)刀裁剪對(duì)應(yīng)區(qū)域的皮膚，要求深度達(dá)到筋膜層。大鼠皮損瘡面上噴灑MRSA菌液，紗布覆蓋，確保與皮膚縫之間貼合良好，然后使用膠布包扎固定。24 h 以后，瘡瘍模型制作完成。利用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分類，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成對(duì)照組、九一丹組、煅石膏組和升丹組，每組8 只。

1.5 干預(yù)方法

造模成功后，對(duì)照組予常規(guī)瘡面消毒后無(wú)菌紗布覆蓋并包扎。九一丹的構(gòu)成主要包括鍛石膏（硫酸鈣）與升丹（即氧化汞）與鍛石膏（硫酸鈣），其配備比例為1∶9，具體用量首先參考九一丹外用安全性及規(guī)范性方案［11］中規(guī)定劑量1.5 mg /cm2，同時(shí)包括人與大鼠之間的體表面積進(jìn)行折算，最終得出的等效劑量對(duì)應(yīng)是9.255 mg/cm2。因此九一丹組在對(duì)照組基礎(chǔ)上均勻布灑定量九一丹于瘡面。煅石膏組按照九一丹組用藥劑量取9 份煅石膏，升丹組按照九一丹組用藥劑量取1 份升丹劑量。每日換藥，并記錄換藥前、換藥后第1 日、第3 日、第5 日、第7日瘡面大小以及其上肉芽、膿腐、上皮的情況。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 瘡面愈合情況 各組分別于造模成功首日、換藥第1、3、7 天用相機(jī)拍取瘡面情況，然后進(jìn)行后期的瘡面愈合率計(jì)算，計(jì)算公式為：（初始日瘡面大?。x材日瘡面大?。?初始日瘡面大小×100%。

1.6.2 瘡面組織形態(tài)學(xué)觀察 選擇相應(yīng)的標(biāo)本，進(jìn)行包埋、固定與切片等處理，使用光學(xué)顯微鏡觀察不同的組織形態(tài)。

1.6.3 ELISA 法檢測(cè)各指標(biāo) 采集大鼠腹部主動(dòng)脈血，離心處理，分離獲取血清，后續(xù)步驟參照上海江萊生物科技有限公司ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，選擇450 nm 波長(zhǎng)，檢測(cè)血清中IL-6、iNOS 與TNF-α含量。

1.6.4 免疫熒光染色 對(duì)各組織進(jìn)行取材、脫水、透明、浸蠟、包埋及切片；按1∶5 0 和1∶2 0 0 比例分別配制滴加F 4/8 0 和C D 1 1 c 抗體，4 ℃過(guò)夜。后續(xù)以1∶2 0 0 比例進(jìn)行配制，滴加Goat anti-Rabbit和Goat anti-Rat 二抗工作液，在37 ℃進(jìn)行孵育，時(shí)間持續(xù)2 小時(shí)。烘片后應(yīng)用抗熒光猝滅封片劑封片。分別于100 倍、400 倍視野進(jìn)行采集；采用ImageJ 軟件，統(tǒng)計(jì)視野下黃色部分熒光光密度。

1.6.5 瘡面細(xì)菌微生物培養(yǎng) 使用一次性無(wú)菌拭子在換藥前、換藥7 d 后瘡面上進(jìn)行取樣，送PCR 檢測(cè)微生物情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及瘡面愈合情況

換藥觀察7 d 后，升丹組死亡2 只，其他各組大鼠精神狀況良好，進(jìn)食等均無(wú)異常。各組大鼠均有瘡面均存在愈合趨勢(shì)，九一丹組、升丹組、煅石膏組瘡面愈合率優(yōu)于對(duì)照組，其中九一丹組愈合情況最佳。換藥第3 天，各組間瘡面大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.931，P＝0.147 5）；換藥第7 天，各組瘡面愈合率具有顯著性差異（F＝17.04，P＜0.001），九一丹組瘡面愈合情況優(yōu)于其余各組，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠瘡面愈合情況（cm2，±s）Tab1 Lesions healing status in the four groups（cm2，±s）

表1 各組大鼠瘡面愈合情況（cm2，±s）Tab1 Lesions healing status in the four groups（cm2，±s）

注：#換藥第7 天，n＝6;*與對(duì)照組比，P＜0.05，△與九一丹組比較，P＜0.05。

愈合率（%）0.83±0.06△0.98±0.02*0.94±0.41*△0.96±0.04*組別對(duì)照組九一丹組升丹組#煅石膏組n8888換藥第3 天4.70±0.80 3.78±0.98 3.73±0.96 4.12±0.64換藥第7 天1.04±0.39△0.16±0.12*0.39±0.15*△0.28±0.23*

2.2 各組大鼠瘡面組織形態(tài)學(xué)觀察

各組大鼠瘡面肉芽組織學(xué)觀察、H & E 染色結(jié)果顯示：末次換藥后，對(duì)照組的中性粒細(xì)胞分布密集，提示炎癥較重，九一丹組及升丹組的中性粒細(xì)胞分布松散，九一丹組纖維組織較多，提示炎癥控制且具有愈合趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

圖1 末次換藥后對(duì)照組（DZ）、九一丹組（JYD）、煅石膏組（DSG）、升丹組（SD）H & E 染色結(jié)果（400×）Fig 1 Morphology changes of lesions in the four groups after the last administration（H & E，400×）

2.3 巨噬細(xì)胞表型因子含量比較

造模成功后，換藥前各組血清中巨噬細(xì)胞M1特異標(biāo)志物IL-6、iNOS 與TNF-α 含量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL-6：F＝1.481，P＝0.255 2；TNF-α：F＝0.361 1，P＝0.781 9；iNOS：F＝1.527，P＝0.243 6）。末次換藥后，各組血清中TNF-α、IL-6、iNOS 含量均呈下降趨勢(shì)，提示炎癥得到控制。九一丹組換藥后血清IL-6、TNF-α、iNOS 含量下降明顯（P均＜0.05）；而對(duì)照組僅換藥前、后血清TNF-α 含量組內(nèi)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.021 9）；煅石膏組（P＝0.030 7）與升丹組（P＝0.014 8）僅換藥前、后血清IL-6 含量組內(nèi)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，換藥后各組間血清特異標(biāo)志物變化亦有差別，結(jié)果顯示九一丹組換藥后血清中IL-6、iNOS 含量與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（IL-6：P＝0.014 8，iNOS：P＝0.021）；煅石膏組與九一丹組比較，血清中TNF-α 含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.021 3），升丹組與九一丹組比較，血清中iN O S 含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.049 3），見(jiàn)圖2～4。

圖2 換藥前后各組IL-6 含量Fig 2 Changes in serum IL-6 concentrations in the four groups before and after medication

2.4 免疫熒光染色結(jié)果

圖3 換藥前后各組TNF-α 含量Fig 3 Changes in serum TNF-α concentrations in the four groups before and after medication

圖4 換藥前后各組iNOS 含量Fig 4 Changes in serum iNOS concentrations in the four groups before and after medication

末次換藥后，免疫熒光染色亮綠色對(duì)應(yīng)是F4/80 表達(dá)部位、亮紅色對(duì)應(yīng)是CD11c 表達(dá)部位、藍(lán)色對(duì)應(yīng)是細(xì)胞核染色表達(dá)，黃色對(duì)應(yīng)是標(biāo)記完成的M1 巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示，M1 巨噬細(xì)胞熒光光密度分析結(jié)果各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝7.221，P＝0.000 4），各組間標(biāo)記的IF 熒光光密度比較結(jié)果顯示，九一丹組（P＝0.003 9）、升丹組（P＝0.047 4）與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5、6。

圖5 各組免疫熒光染色結(jié)果Fig 5 Tissue immunofluorescence double staining results of the four groups

圖6 各組免疫熒光染色I(xiàn)F 熒光光密度比較Fig 6 Optical density revealed by immunofluorescence staining double staining in the four groups

2.5 瘡面細(xì)菌微生物培養(yǎng)結(jié)果

各組造模成功后均提示MRSA 感染。在換藥干預(yù)后，重新采集瘡面分泌物作細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果顯示，九一丹組轉(zhuǎn)陰5 例，升丹組轉(zhuǎn)陰5 例，煅石膏組轉(zhuǎn)陰1 例，對(duì)照組無(wú)轉(zhuǎn)陰病例。

3 討論

巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)期間發(fā)揮關(guān)鍵作用，這種細(xì)胞不僅可以清除并且吞噬微生物與壞死組織，也可以分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子，利用這種方式針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，有效地刺激細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管化與肉芽自身的新生。同時(shí)，不同表型的巨噬細(xì)胞具備多種不同的生理功能。巨噬細(xì)胞類型主要涵蓋了兩種形式，分別對(duì)應(yīng)是M1 型，也就是經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞，同時(shí)包括M2 型，也就是選擇性激活的巨噬細(xì)胞［12］。在炎癥階段，M1 型巨噬細(xì)胞可以直接分泌TNF-α、IL-6 等，參與后續(xù)的炎癥反應(yīng)。炎癥發(fā)生以后會(huì)轉(zhuǎn)化為M2 型，分泌比如Arg-1、CD206 等抑炎因子，參與組織修復(fù)和傷口愈合［13-15］。近年來(lái)，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥干預(yù)瘡面上巨噬細(xì)胞表型變化，對(duì)瘡面愈合具有積極作用。劉宸等［9］分析了糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的整個(gè)過(guò)程，初期巨噬細(xì)胞整體數(shù)量比較少，在愈合后期則持續(xù)在創(chuàng)面上表達(dá)，其表型相關(guān)的各類細(xì)胞因子表達(dá)亦呈動(dòng)態(tài)變化，提示巨噬細(xì)胞可能與糖尿病創(chuàng)面愈合有關(guān)聯(lián)。蒙玉嬌等［16］的研究結(jié)果表明，活血通絡(luò)方和益氣溫陽(yáng)方有利于小鼠皮膚慢性瘡面實(shí)際的愈合，促進(jìn)瘡面從炎癥期向增殖期方向發(fā)展。林燕等［17］亦綜述了巨噬細(xì)胞胞葬作用與表型轉(zhuǎn)換在慢性皮膚潰瘍具有改善作用。

升丹是治療外科“癰疽腫毒”的良藥?！锻饪普凇ど嘴`藥法》中記錄：“凡瘡久不收口，用此研細(xì)摻上少許，其口易完，若入于一概收斂藥中用之，其功奇甚捷。”意為如若遇瘡久不收口的情況，利用升丹研細(xì)摻入其中，可有奇效。因此，既往就有外科不離紅、白二丹的說(shuō)法。升丹成分主要包括氧化汞，汞制劑本身有腐蝕性與毒性，因此在臨床應(yīng)用需要增加賦形藥，將外用升丹制劑按比例配伍，根據(jù)膿腐的比例選擇合適的藥物。九一丹整體療效較好，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，因此臨床應(yīng)用非常廣泛。研究結(jié)果顯示［18，19］，升丹自身的藥理作用主要包括：（1）殺菌：升丹內(nèi)部的HgO 可以還原得到Hg2+和細(xì)菌呼吸酶內(nèi)部的巰基結(jié)合，造成細(xì)菌死亡。（2）祛腐：硝酸汞屬于可溶性鹽類，加入水以后會(huì)進(jìn)行分解得到酸性溶液，有一定的腐蝕作用，可將病變組織中的蛋白質(zhì)壞死，同時(shí)和健康組織之間進(jìn)行分離。（3）生?。荷ぶ苿┠艽碳?chuàng)面肉芽中毛細(xì)血管生成和擴(kuò)張，減少微血栓，有利創(chuàng)面愈合。本課題組九一丹使用小劑量升丹，前期研究主要用于治療乳房部慢性難愈性瘡面，在臨床已取得確切療效［19-21］，證實(shí)九一丹具有良好的祛腐生肌作用。但既往尚未有九一丹作用機(jī)制的研究，因此本研究通過(guò)設(shè)立九一丹及其有效組分升丹組、煅石膏組及對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，是對(duì)前期研究結(jié)果的補(bǔ)充。結(jié)果顯示，九一丹組及升丹組對(duì)瘡面MRSA 耐藥菌具有較好的抑制作用；另外，本研究發(fā)現(xiàn)九一丹可抑制炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞細(xì)胞TNFα 的分泌，并降低IL-6、iNOS 等炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生，免疫熒光染色標(biāo)記結(jié)果也提示九一丹能夠降低M1 巨噬細(xì)胞極化。與此同時(shí)，九一丹組瘡面脫腐、愈合方面均優(yōu)于單獨(dú)對(duì)照組和煅石膏組；雖然升丹組表現(xiàn)出較好的脫腐效果，但組內(nèi)大鼠致死率較高，其安全性較差?？梢?jiàn)，九一丹中的升丹成分能夠發(fā)揮良好的提膿祛腐作用，同時(shí)配伍煅石膏來(lái)稀釋升丹濃度，減少局部毒副作用的產(chǎn)生。九一丹的經(jīng)典配伍相輔相成，可發(fā)揮減毒穩(wěn)效的效果。

綜上，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)九一丹及其有效組分可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞M1 表型，對(duì)炎性瘡面起到祛腐生肌的作用。同時(shí)通過(guò)有效組分拆方對(duì)照，明確九一丹配伍比例能夠在安全性的基礎(chǔ)上確保其有效性。并且從巨噬細(xì)胞表型極化角度探究九一丹及其有效組分的潛在作用環(huán)節(jié)及靶點(diǎn)，今后擬進(jìn)行更深入的研究，為九一丹這一經(jīng)典的中醫(yī)傳統(tǒng)外用藥劑補(bǔ)充理論基礎(chǔ)，有利于九一丹在外科臨床領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。