王 銳，李婭蘭，白皓天，楊 婧

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅花（Carthamus tinetoriusL），又被稱為“紅藍(lán)花”。本草學(xué)考證認(rèn)為，“紅花”最早出現(xiàn)在《新修本草》中，為活血散瘀藥，它可以幫助循環(huán)和減輕疼痛，排除血瘀［1］。許多報道指出，紅花具有抑制冠狀動脈肥大、抗氧化、抗心肌缺血、抗凝血、抗血栓形成等多種生物學(xué)活性［2-4］。除了作為中藥使用外，紅花還廣泛用于中藥生產(chǎn)，如紅花油、紅花口服液、紅花注射液和紅花粉等［5，6］。目前關(guān)于紅花羥基黃色素、紅花羥基紅色素以及黃酮類成分研究較多，而對紅花多糖研究較少。紅花多糖是紅花的主要化學(xué)組成成分之一，主要結(jié)構(gòu)是葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖［7］。近年來，國內(nèi)外對紅花多糖的研究主要側(cè)重于其抗癌作用和免疫調(diào)節(jié)作用。Yang 等［8］通過體外實驗已經(jīng)證實紅花多糖在體外可以抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以作為一種有效的抗宮頸癌藥物的候選藥物。因此研究其最佳提取工藝對紅花多糖的開發(fā)利用有一定的促進(jìn)作用。

星點設(shè)計-效應(yīng)面法主要是調(diào)查獨立變量效果的五因素五級實驗項目，其基本原理是描述研究因子相互作用對應(yīng)的效果表面，從效果表面選擇最佳效果面積，按照最佳實驗條件-最佳效果區(qū)域推測所研究的獨立變量的值范圍［9］。星點設(shè)計實驗次數(shù)較少、預(yù)測性好、應(yīng)用方便，可以在一定程度上改善正交實驗的缺點，并且較好地保證了實驗的精確度。盡管星點設(shè)計-效應(yīng)面法足以進(jìn)行因子分析，但精度仍不足以完全取代傳統(tǒng)設(shè)計，最好首先使用星點效應(yīng)面法查找最佳區(qū)域，然后將效應(yīng)面優(yōu)化方法應(yīng)用于較小范圍［10，11］。充分發(fā)揮星點設(shè)計-效應(yīng)面法的最大優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FA2004 分析天平（上海良平儀器儀表有限公司），TDL-40B 臺式離心機(jī)（上海安亨科學(xué)儀器廠），數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），TU -1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），OSB-2200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA 株式社會），葡萄糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝 采用水提醇沉法：稱取一定量的干燥紅花，放入鍋中并加入蒸餾水，間隔30 min 煎煮一次，共煮3 次之后濃縮至原有體積的1/3。加入4 倍體積的95% 乙醇，放入冰箱冷卻24 h 后取出，于離心機(jī)中3 000 r/min，離心30 min 得沉淀。將沉淀用去離子水溶解后用95% 乙醇反復(fù)沉淀2～3 次，使得紅花多糖充分溶出，得到的沉淀45 ℃烘干，最后得到棕黃色固體即紅花多糖。

1.2.2 紅花多糖的含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取20 mg 無水干燥葡萄糖于200 mL 容量瓶中，定容至刻度。將溶液中的0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 準(zhǔn)確吸到帶塞子的10 mL 試管中，定容至2.0 mL。配制成5～50 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液［12］。取2.0 mL 蒸餾水將其作為一個空白。

紅花多糖溶液的配制：按照標(biāo)準(zhǔn)溶液配制步驟，配制紅花多糖溶液濃度為200 μg/mL。從多糖溶液中吸取4～20 mL 到具塞試管中，加水定容至2.0 mL，即制備成40 μg/mL 的多糖溶液。

測定最大吸收波長：精確量取上述葡萄糖液和多糖溶液各1.0 mL，并將試管中加入蒸餾水1.0 mL，分別與5% 苯酚溶液1.0 mL 以及5.0 mL 的濃硫酸混合，密封，冷卻至室溫。在400 nm～700 nm 之間進(jìn)行掃描，以確定最高吸收波長。

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：在上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中加入1 mL 苯酚以及5 mL 濃硫酸，室溫放置至冷卻，于481 nm 處測定其溶液的吸光度（OD）。

1.2.2.2 精密度實驗 準(zhǔn)確稱量20 mg 的多糖樣品，并在481 nm 的條件下按照“1.2.2.1”下的方法，連續(xù)測定6 次。

1.2.2.3 重復(fù)性實驗 精度稱取6 個多糖樣品，按照“1.2.2.1”方法制備6 個濃度為0.1 mg/mL濃度的溶液，并確定OD 值。

1.2.2.4 穩(wěn)定性實驗 按“1.2.2.1”項下操作，對同一樣品分別在0～200 min 處測定OD 值。

1.2.2.5 加樣回收率實驗 準(zhǔn)確稱取20 mg 紅花多糖，將其放入100 mL 容量瓶中定容至刻度，再吸取1.0 mL 定容至10 mL。精密吸取6份1.0 mL 多糖樣品溶液，放入20 mL 試管中，分別加入30、50 μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 各3 份，按照“1.2.2.1”項下方法操作，根據(jù)公式計算回收率。將20 mg 紅花多糖置于容量為100 mL 的容量瓶，吸取其中1.0 mL 溶液，加水至10 mL。分別吸取6 種1.0 mL 多糖樣品溶液于20 mL 試管中，各自添加3 份濃度為30、50 μ g/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照“1.2.2.1”下方法計算回收率。

回收率＝（M-C）÷V×100%

其中M 是混合后測得多糖量，C 是樣品中多糖量，V 是葡萄糖加入量。

1.2.2.6 多糖含量的測定 正確稱量20 mg 的多糖，放入100 mL 容量瓶中充分?jǐn)嚢杈鶆?，?.0 mL 加水至10 mL。 從樣品溶液中取1.0 mL，按照“1.2.2.1”項下測定OD 值，根據(jù)公式計算含量。

1.2.3 單因素考察實驗

1.2.3.1 考察不同因素對提取率的影響 固定其他條件不變，將料液比改為1∶5～1∶20，提取時間為30～120 min，改變提取次數(shù)為1～4 次，改變提取溫度為70～100 ℃，按照“1.2.1”項下制備紅花多糖，進(jìn)行考察紅花粗多糖提取率的變化試驗。

1.2.4 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化紅花多糖提取工藝

1.2.4.1 星點實驗設(shè)計 根據(jù)單因素分析得出，提取次數(shù)對紅花粗多糖提取率無顯著影響（P＞0.05），因此以單因素考察實驗為依據(jù)，設(shè)定料液比（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）為考察因素，以紅花多糖提取率（Y）作為評價指標(biāo)，各項因子均設(shè)置5 水平。分別用-α、-1、0、+1、+α 表示，對于三因素的星點設(shè)計α ＝1.682。實驗因素與水平層次安排見表1。

表1 星點設(shè)計-效應(yīng)面法的因素水平Tab 1 Factor level of central point design-response surface method

2 結(jié)果

2.1 紅花多糖含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 通過使用紫外分光光度計掃描范圍為400～700 nm 來確定紅花多糖最大吸收波長。見圖1、2。

采用苯酚-硫酸法［13］。由圖1、2 可知，葡萄糖和紅花多糖都在481 nm 有最大吸收，因此葡萄糖能夠用作紅花多糖的標(biāo)準(zhǔn)對照品，以確定其含量。

圖1 紅花多糖紫外掃描曲線Fig 1 UV scanning curve of safflower polysaccharide

圖2 葡萄糖紫外掃描曲線Fig 2 UV scanning curve of glucose

參照“1.2.2.1”下方法，以O(shè)D（A）為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，根據(jù)目標(biāo)檢測技術(shù)分析數(shù)據(jù)結(jié)果繪制一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性關(guān)系模型回歸。見圖3。得出OD 值對于葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝0.009 2X-0.004 9（R2＝0.999 9），由曲線可知，OD 值與葡萄糖濃度在5～50 μg/mL 的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 Standard curve

2.1.2 精密度實驗 在481 nm 下，經(jīng)6 次測定，平均OD 為0.151，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation）為1.859%，平均加樣回收率為16.945±0.287，表明此方法精密度預(yù)測性良好。見表2。

表2 紅花多糖含量測定精密度實驗結(jié)果Tab 2 Precision experimental results of determination of safflower polysaccharide content

2.1.3 重復(fù)性實驗 遵循方法“1.2.2.3”，RSD 為2.257%，平均加樣回收率為16.891±0.348，表明重復(fù)性良好。見表3。

表3 紅花多糖含量測定重復(fù)性實驗結(jié)果Tab 3 Repetitive experimental results of determination of safflower polysaccharide content

2.1.4 穩(wěn)定性實驗 按照“1.2.2.4”方法下操作，200 min 過后吸光度有下降趨勢，多糖溶液在200 min 以內(nèi)都是穩(wěn)定存在。RSD 為2.393%，平均加樣回收率為（16.809±0.369）%。見表4。

表4 紅花多糖含量測定穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab 4 Stability test results of safflower polysaccharide content determination

2.1.5 加樣回收率實驗 按照“1.2.2.5”方法下操作，檢測結(jié)果為平均加樣回收率為（97.320±0.026）%，RSD 為2.949%。見表5。

表5 葡萄糖加樣回收率測定結(jié)果實驗結(jié)果Tab 5 Determination results of recovery rate of glucose sampling experimental results

2.1.6 多糖含量的測定 按照“1.2.2.6”項下對多糖進(jìn)行含量測定，多糖平均含量為（98.304±0.009）%，RSD 為1.076%。見表6。

表6 紅花多糖含量的測定Tab 6 Determination of polysaccharide content in safflower

2.2 單因素考察結(jié)果分析

2.2.1 考察料液比對提取率對影響 由圖4 可知，不同料液比對于多糖的影響較大，當(dāng)料液比大于1∶1 時，料液比對多糖含量影響顯著，料液比超過1∶15 時提取率有所下降，可能原因是加水量過大，藥物過于稀釋，造成提取率降低，所以最佳料液比1∶15。

圖4 料液比對多糖提取率的影響Fig 4 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.2.2 考察提取時間對提取率對影響 圖5 顯示，當(dāng)提取時間約為90 min 時，提取率隨著時間的推移而增加，超過90 min，提取率下降，因此90 min 為最佳方法提取工作時間。

圖5 提取時間對多糖提取率的影響Fig 5 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

2.2.3 考察提取次數(shù)對多糖提取率對影響 圖6 顯示次數(shù)為2 時，多糖提取率最高，提取次數(shù)越多，多糖損失越大，因此最佳提取次數(shù)為2。

圖6 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig 6 Effect of extraction times on polysaccharide extraction rate

2.2.4 考察提取溫度對提取率的影響 從圖7 中可以看出，多糖的提取率隨著溫度的升高而升高，其中提取率最高時為90 ℃，是60 ℃的兩倍之多，因此，選擇90℃作為最佳提取溫度。

圖7 提取溫度對多糖提取率的影響Fig 7 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide

2.3 星點實驗設(shè)計結(jié)果與分析

2.3.1 模型擬合 通過Design Expert 8.0 軟件分別對各因素的各水平不斷進(jìn)行二次多項式方程模型擬合。根據(jù)該方程通過Design Expert 8.0 軟件繪制出三維效應(yīng)面和二維等高線，選取較優(yōu)組 合 。 二 次 方 程 擬 合 ：Y＝6.81+0.4X1-0.0094X2+0.15X3+0.0015X1X2+0.0025X1X3-0.015X2X3-0.36X12-0.19X22-0.35X32，P＜0.05，R2＝0.942 3，說明回歸方程關(guān)系顯著，符合要求。方差結(jié)果分析見表8。結(jié)果分析，Y模型項P＜0.000 1，證明所得回歸方程的作用顯著。在Y模型方程中，X1，X1X3，X12，X22，X32都是一個顯著項，是Y的顯著相關(guān)影響因素。因此3 個因素對提取率的影響為：X1＞X3＞X2，X1對提取率有顯著影響。使用statistica 8.0 軟件處理后得到二維等高線及三維效應(yīng)面圖，確定最優(yōu)方案為：料液比1∶16.69，提取時間89.78 min，提取溫度 91.39 ℃。 此時紅花多糖的提取率為7.45%。

表7 星點設(shè)計實驗安排結(jié)果Table 7 Experimental results of central composite designresponse surface methodology

表8 方差結(jié)果分析Tab 8 Analysis of variance results

各因素間交互作用的三維效應(yīng)曲面圖和二維等高線如圖8～10 所示。

圖8 提取時間與料液比對紅花多糖提取率的效應(yīng)曲面及其等高線圖Fig 8 Surface and contour map of effect of extraction time and solid-liquid ratio on extraction rate of safflower polysaccharide

圖9 提取溫度與料液比對紅花多糖提取率的效應(yīng)曲面及其等高線圖Fig 9 Surface and contour map of effect of extraction temperature and solid-liquid ratio on extraction rate of safflower polysaccharide

圖8～圖10 的效應(yīng)曲面圖和等高線圖反映了料液比（X1）、提取時間（X2）和提取溫度（X3）的交互效應(yīng)對紅花多糖提取率的影響。其影響曲面顯著程度由大到小依次為X1＞X3＞X2，此結(jié)果和方差分析的結(jié)論一致。

圖10 提取溫度與提取時間對紅花多糖提取率的效應(yīng)曲面及其等高線圖Fig 10 Surface and contour map of effect of extraction temperature and extraction time on extraction rate of safflower polysaccharide

2.4 紅花多糖提取工藝驗證試驗

平行稱取紅花多糖3 份，根據(jù)供試產(chǎn)品的制備方法，在最佳工藝條件下進(jìn)行操作，測定紅花多糖提取率，實驗結(jié)果表明在最佳提取工藝條件下，紅花多糖提取率高且穩(wěn)定。見表9。

表9 驗證試驗結(jié)果Tab 9 Verification test results

3 討論

常用的測定不同多糖進(jìn)行含量的實驗研究方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法等［14，15］。苯酚-硫酸法比其他通常用來確定多糖含量的方法更敏感、使用更方便、顏色更穩(wěn)定［16］。紫外光度計法檢測多糖的靈敏度較高，但穩(wěn)定性不是很好，實驗過程由于操作、吸收時間、顯色過程中等錯誤因素導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)誤差，在某種程度上，它影響了實驗結(jié)果［17］。

在本實驗中，水提醇沉法提取得到的多糖破壞較小，得率較高［18］。通過單因素考察實驗對各因素進(jìn)行一定的考察，進(jìn)一步縮小各因素取值范圍。按照星點設(shè)計-效應(yīng)面法挑選出最優(yōu)的紅花粗多糖提取工藝條件。與其他設(shè)計實驗相比，星點設(shè)計-效應(yīng)面法具有精確度高、可預(yù)測性好、實驗少、可同時考察各種因素相互作用等優(yōu)點，證明該方法具有一定的研究價值［19，20］。本研究得到的工藝優(yōu)化條件，可為紅花多糖的開發(fā)利用奠定一定的基礎(chǔ)，使紅花多糖在臨床研究方面有一定的突破。

作者貢獻(xiàn)度說明：

本文設(shè)計思路由楊婧教授提供；具體實驗過程由王銳、李婭蘭完成；數(shù)據(jù)分析與結(jié)果處理由白皓天完成。