王 沖,李玲玲,李夢(mèng)亞,申曉輝,王樹娟

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

端粒重復(fù)結(jié)合蛋白1(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是第1個(gè)被鑒定出來的端粒DNA結(jié)合蛋白，TRF1是經(jīng)典的端粒長(zhǎng)度負(fù)向調(diào)控因子，可通過抑制端粒酶的活性來調(diào)控端粒長(zhǎng)度[1]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，過量表達(dá)TRF1能夠促進(jìn)細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂期，此外，TRF1能夠通過調(diào)節(jié)著絲粒蛋白的功能參與細(xì)胞有絲分裂期染色體分離的調(diào)控[2-3]，且在有絲分裂期受到重要激酶周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases 1，CDK1)的磷酸化調(diào)控[4-5]。以上研究結(jié)果提示，端粒相關(guān)蛋白有可能通過翻譯后修飾參與細(xì)胞有絲分裂期染色體分離的調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步探討TRF1在細(xì)胞有絲分裂期的翻譯后修飾機(jī)制，本研究采用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定TRF1在有絲分裂期的磷酸化位點(diǎn)，并對(duì)TRF1與Aurora B在體內(nèi)外的相互作用進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由鄭州大學(xué)血液病研究所提供；胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司，正常小鼠血清購自翌圣生物科技有限公司，青霉素、鏈霉素、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)、pcDNA3.1-myc-His、pEGST-C3、PET-18a、pEGFP-C3質(zhì)粒購自美國(guó)Invitrogen公司，胰蛋白酶購自華美生物工程有限公司，鼠抗綠色熒光蛋白(grean fluorescent protein,GFP)單克隆抗體9B11、鼠抗谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)單克隆抗體購自美國(guó)Cell Signaling公司，羅丹明偶聯(lián)羊抗鼠IgG抗體(二抗)購自美國(guó)Jackson Immunoresearch公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA連接酶、pyrobest酶及相關(guān)緩沖液購自日本TaKaRa公司，GST蛋白純化樹脂購自日本Qiagen公司，Ni-NTA蛋白純化樹脂試劑盒購自美國(guó)Merck Millipore公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增TRF1片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切后，以T4 DNA連接酶插入pcDNA3.1-myc-His、pEGST-C3質(zhì)粒載體，構(gòu)建帶有myc-His標(biāo)記的TRF1真核表達(dá)質(zhì)粒和帶有GST標(biāo)記的TRF1原核表達(dá)質(zhì)粒；通過PCR擴(kuò)增Aurora B片段，經(jīng)過EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切后，以T4 DNA連接酶插入PET-18a、pEGFP-C3質(zhì)粒，構(gòu)建His-Aurora B原核表達(dá)質(zhì)粒、GFP-Aurora B真核表達(dá)質(zhì)粒。

1.3 重組載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞將人宮頸癌Hela細(xì)胞用胰蛋白酶消化并接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)輕輕洗滌1遍，然后加入4 mL新鮮培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時(shí)取myc-His-TRF1真核表達(dá)質(zhì)粒及其空白對(duì)照轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，4 h后棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用預(yù)熱的PBS輕輕洗滌1遍，然后加入15 mL新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書及本課題組前期研究[6]。

1.4 8 mol·L-1尿素變性蛋白提取及質(zhì)譜分析將pcDNA3.1-myc-His-TRF1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，加入8 mol·L-1尿素裂解，裂解產(chǎn)物加入Ni-NTA樹脂后，按照Ni-NTA樹脂說明書操作，沉淀復(fù)合物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，切除凝膠行質(zhì)譜鑒定。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)免疫共沉淀情況免疫沉淀：收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的細(xì)胞，用4 ℃ PBS洗滌，加入0.5 mL 4 ℃放射免疫沉淀緩沖液(radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA)裂解。4 ℃下12 000×g離心30 min后取上清，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，將細(xì)胞裂解液與正常小鼠血清及蛋白A和蛋白G瓊脂凝膠珠共旋轉(zhuǎn)。4 ℃下12 000×g離心30 min后取上清，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，取出少量上清(約為離心產(chǎn)物總體積的5%)作為內(nèi)參保存，在離心管中加入1 μg FLAG標(biāo)簽抗體或GFP標(biāo)簽抗生，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜以捕獲目的蛋白。免疫印跡：蛋白裂解物及免疫沉淀復(fù)合物用上樣緩沖液加熱變性，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入二抗孵育12 h后，用化學(xué)發(fā)光底物壓片顯影。

1.6 GST融合蛋白純化及體外沉降實(shí)驗(yàn)參照谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶結(jié)合蛋白純化說明書進(jìn)行操作。純化獲取的重組蛋白質(zhì)4 ℃保存。體外沉降實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見本課題組前期研究[7]。細(xì)胞裂解液經(jīng)RIPA緩沖液預(yù)清除后，與谷胱甘肽瓊脂糖珠對(duì)照和相應(yīng)的谷胱甘肽瓊脂糖珠融合蛋白共同孵育，隨后行SDS-PAGE分離產(chǎn)物，行考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印跡分析。

2 結(jié)果

2.1 myc-His-TRF1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建所得產(chǎn)物質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，成功構(gòu)建了含TRF1全長(zhǎng)片段的真核表達(dá)質(zhì)粒(圖1)，經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列無誤。

1：DNA marker；2：EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ雙酶切后的pcDNA3.1-myc-His-TRF1質(zhì)粒；3：空白對(duì)照。

2.2 8 mol·L-1尿素變性Ni-NTA沉淀結(jié)果結(jié)果見圖2和圖3。所得沉降產(chǎn)物切除后行質(zhì)譜分析，鑒定出5個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)，其中第296位絲氨酸和第417位絲氨酸2個(gè)位點(diǎn)符合Aurora B激酶磷酸化修飾肽段結(jié)構(gòu)，表明這2個(gè)位點(diǎn)可能是潛在的Aurora B激酶磷酸化位點(diǎn)。

A:免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS變性分離結(jié)果;B:細(xì)胞裂解液及免疫沉淀產(chǎn)物蛋白質(zhì)印跡結(jié)果;1：蛋白質(zhì)marker；2：pcDNA3.1-myc-His-TRF1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞裂解液；3：細(xì)胞裂解液Ni-NTA沉淀產(chǎn)物。

圖3 5個(gè)新的TRF1的磷酸化位點(diǎn)及Aurora B磷酸化修飾肽段結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 Aurora B與TRF1免疫共沉淀結(jié)果結(jié)果見圖4。Flag-TRF1能夠與GFP-Aurora B野生型及其激酶活性缺失體GFP-Aurora B KD相結(jié)合，形成復(fù)合物，而空GFP蛋白則不能與Flag-TRF1形成復(fù)合物。

A:細(xì)胞裂解液及免疫共沉淀產(chǎn)物的GFP免疫印跡結(jié)果；B:細(xì)胞裂解液及免疫共沉淀產(chǎn)物的FLAG免疫印跡結(jié)果。

2.4 Aurora B與TRF1體外沉降實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見圖5。GST-TRF1能夠與His-Aurora B在體外相結(jié)合，形成復(fù)合物，而空GST蛋白不能與His-Aurora B形成復(fù)合物。

A:細(xì)胞裂解液及免疫共沉淀產(chǎn)物的GFP免疫印跡結(jié)果；B:細(xì)胞裂解液及免疫共沉淀產(chǎn)物的FLAG免疫印跡結(jié)果。

3 討論

端粒是存在于真核細(xì)胞染色體末端由DNA重復(fù)序列和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，起到保持染色體的完整性和控制細(xì)胞分裂周期的作用。TRF1是被鑒定出的第1個(gè)人端粒雙鏈結(jié)合蛋白。TRF1是端粒長(zhǎng)度的負(fù)向調(diào)控因子，TRF1的功能缺失可導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度異常增加[7]。此外，TRF1蛋白在細(xì)胞有絲分裂期能夠與多種激酶蛋白如CDK1、Aurora A、Plk1等相互結(jié)合[8-9]。以上研究表明，TRF1及其相互作用蛋白可能在細(xì)胞周期的調(diào)控中起到重要作用。本課題組前期研究表明，TRF1能夠與多種參與細(xì)胞有絲分裂時(shí)期調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用，但其作用機(jī)制目前仍不完全清楚[6]。因此，進(jìn)一步研究TRF1的翻譯后修飾調(diào)控機(jī)制，有可能為細(xì)胞有絲分裂調(diào)控的生物學(xué)功能研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究中，采用8 mol·L-1尿素變性結(jié)合蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，鑒定出5個(gè)新的TRF1的磷酸化位點(diǎn)，第296位絲氨酸和第417位絲氨酸有可能是Aurora B的磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有絲分裂期重要激酶Aurora B能夠與TRF1在體內(nèi)形成復(fù)合物。Aurora B是有絲分裂期重要的磷酸化激酶，在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中發(fā)揮重要功能；此外，Aurora B在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且在p53以及核因子-κB等重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也起到調(diào)控作用[10-11]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，端粒結(jié)合蛋白TRF1能夠與激酶相關(guān)蛋白Aurora B在體內(nèi)相互結(jié)合，這為進(jìn)一步鑒定TRF1在細(xì)胞有絲分裂期的生物學(xué)功能研究提供了新的研究線索和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，本研究鑒定出TRF1新的磷酸化修飾位點(diǎn)；通過體內(nèi)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和體外沉降實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRF1能夠與Aurora B在體內(nèi)外相互結(jié)合。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TRF1有可能在細(xì)胞有絲分裂期被多種磷酸化激酶修飾，而磷酸化修飾可能是TRF1參與細(xì)胞有絲分裂期染色體分離調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。本研究為進(jìn)一步探討端粒相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。