尚萬(wàn)兵,王 變

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

胃癌是常見的惡性腫瘤，其主要治療方式為手術(shù)切除，早期胃癌患者術(shù)后5 a生存率可達(dá)90%以上，但因胃癌早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，治療效果不理想[1-3]。因此，深入探究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，明確相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，以及研發(fā)分子靶向藥物等對(duì)胃癌的早期診斷、治療和預(yù)后具有重要的價(jià)值。活化白細(xì)胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)又稱CD166，是免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛存在于各組織器官中，可通過(guò)其黏附作用介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，參與多種生理、病理過(guò)程[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，CD166在胃癌中高表達(dá)[6],但其如何影響胃癌的發(fā)生尚不清楚，基于此，本研究觀察CD166對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步探討CD166在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、試劑與儀器6～8周齡BALB/c裸鼠(18～23 g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；人胃癌細(xì)胞株AZ-521購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司；RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清和脂質(zhì)體2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗CD166多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建；SpectraMax L酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司，CFX96型實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將AZ-521細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AZ-521細(xì)胞分為對(duì)照組和CD166組，待細(xì)胞融合至60%左右時(shí)，參照脂質(zhì)體2000試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒空載質(zhì)粒，CD166組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒質(zhì)粒，8 h后于DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qPCR法檢測(cè)AZ-521細(xì)胞中CD166 mRNA表達(dá)水平根據(jù)CD166 mRNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，CD166上游引物序列為5′-GATCTCCGCCACCGTCTTCAG-3′；CD166下游引物序列為5′-CGTCGTACTGCACACTTTTC-3′。取對(duì)照組和CD166組細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR體系：熒光染料 10 μL,上下游引物各0.6 μL，cDNA 8.8 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算2組細(xì)胞中CD166 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法檢測(cè)AZ-521細(xì)胞中CD166蛋白的表達(dá)收集對(duì)照組和CD166組細(xì)胞，加入1×上樣緩沖液，沸水浴中煮20 min；然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉120 min，CD166兔多克隆抗體、β-actin小鼠單克隆抗體 4 ℃孵育過(guò)夜，抗體稀釋液洗滌3次，每次5 min；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，加入含Twen-20的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min；暗室中發(fā)光顯影，掃描蛋白條帶，應(yīng)用Image J軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算CD166蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 CCK-8檢測(cè)AZ-521細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)照組和CD166組AZ-521細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于96孔板中(每孔8×103個(gè)細(xì)胞，每孔100 μL)，分別培養(yǎng)12、24、48 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃下避光反應(yīng)4 h，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處的吸光度值，吸光度值越高，表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.6 吉姆薩染色檢測(cè)AZ-521細(xì)胞克隆形成能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)照組和CD166組細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，分別取100個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基，至第12天時(shí)細(xì)胞克隆基本形成。棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液洗1遍，室溫下甲醇固定10 min，雙蒸水清洗1遍，超凈臺(tái)風(fēng)干。加入吉姆薩染液染色20 min，雙蒸水清洗1遍，超凈臺(tái)風(fēng)干。統(tǒng)計(jì)50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)目。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值。

1.7 動(dòng)物腫瘤模型制備將46只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和CD166組，每組23只。2組裸鼠稱質(zhì)量后腹腔注射戊巴比妥(40 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉，待小鼠失去意識(shí)后，于小鼠左側(cè)腋下接種對(duì)照組細(xì)胞(1×106個(gè))，于右側(cè)腋下接種CD166組細(xì)胞(1×106個(gè))，觀察并統(tǒng)計(jì)2組小鼠存活情況和成瘤狀況，連續(xù)統(tǒng)計(jì)30 d。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與CD166組AZ-521細(xì)胞中CD166 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖1。對(duì)照組和CD166組AZ-521 細(xì)胞中CD166 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.21±0.24、3.58±0.56，CD166蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.08、1.41±0.21；CD166組 AZ-521 細(xì)胞中CD166 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.738、8.401,P<0.05)。

圖1 對(duì)照組和CD166組AZ-521細(xì)胞中CD166蛋白表達(dá)(Western blot)

2.2 對(duì)照組與CD166組AZ-521細(xì)胞增殖能力的比較結(jié)果見表1。培養(yǎng)12、24 h時(shí)，對(duì)照組與CD166組AZ-521細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)48 h時(shí)，CD166組AZ-521細(xì)胞的增殖能力顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 對(duì)照組與CD166組AZ-521細(xì)胞增殖能力比較

2.3 對(duì)照組與CD166組AZ-521細(xì)胞克隆形成能力比較結(jié)果見圖2。對(duì)照組和CD166組AZ-521細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(28.96±5.63)、(52.01±6.01)個(gè)；CD166組AZ-521細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.848,P<0.05)。

圖2 對(duì)照組和CD166組AZ-521細(xì)胞克隆形成情況(吉姆薩染色，×200)

2.4 動(dòng)物模型成瘤結(jié)果移植瘤模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線見圖3。腫瘤建模過(guò)程中，對(duì)照組小鼠死亡1只，未成瘤1只；CD166組小鼠死亡2只，其余均建模成功。第30 天時(shí)，CD166組小鼠的腫瘤體積顯著大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.291,P<0.05)。

圖3 對(duì)照細(xì)胞和CD166組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

3 討論

CD166為免疫球蛋白家族的一類單鏈跨膜糖蛋白，是淋巴細(xì)胞抗原CD6的配體，廣泛分布于活化的白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、神經(jīng)元、造血干細(xì)胞、間葉組織干細(xì)胞等多種細(xì)胞中，參與機(jī)體的細(xì)胞黏附、造血、炎癥等多種生物學(xué)過(guò)程[7-9]。近年來(lái)諸多研究顯示，CD166參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用[10-11]。目前研究顯示，CD166在惡性黑色素瘤、胰腺癌、食管癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌以及乳腺癌中高表達(dá)，并與腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)侵襲密切相關(guān)[12-16]。但關(guān)于胃癌組織中CD166表達(dá)及作用機(jī)制的研究較少，本研究旨在探究高表達(dá)CD166與胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CD166的AZ-521細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞形成克隆能力及成瘤能力均明顯提高；提示高表達(dá)CD166與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。已有研究證明，CD166可能是通過(guò)以下途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生和浸潤(rùn)侵襲：CD166可促進(jìn)前體基質(zhì)金屬蛋白酶-2向活化基質(zhì)金屬蛋白酶-2的轉(zhuǎn)變，而基質(zhì)金屬蛋白酶-2在細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解中起著重要作用，細(xì)胞外基質(zhì)的加速降解又促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[17]。但也有研究表明，在某些腫瘤中CD166表達(dá)減弱，降低了細(xì)胞的黏附能力和能動(dòng)性，從而促進(jìn)了腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[18]。因此，CD166在不同腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色仍需進(jìn)一步研究和探索。

綜上所述，高表達(dá)CD166可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及生長(zhǎng)，加快胃癌的發(fā)展進(jìn)程，檢測(cè)胃組織中CD166的表達(dá)對(duì)胃癌的早期鑒定、治療及預(yù)后評(píng)估具有一定的參考價(jià)值。