梁曉潔，劉向玲，李曉鵬

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是指由低胎齡、低體質(zhì)量、缺氧、炎癥和感染等因素引起的視網(wǎng)膜血管發(fā)育異常的可致盲眼底疾病，其病理機(jī)制尚未闡明[1]。近年來，炎癥與ROP新生血管形成之間的關(guān)系備受關(guān)注。新生血管形成涉及多種因子和信號通路，除了熟知的血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子1α、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、成纖維生長因子和胎盤生長因子等，深入了解和探索視網(wǎng)膜新生血管形成的其他致病因子對于開發(fā)ROP的治療藥物至關(guān)重要。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)作為一種高度保守的核DNA結(jié)合蛋白，是炎癥反應(yīng)中重要的炎癥介質(zhì)或促炎細(xì)胞因子。HMGB1作為在缺氧期間典型的損傷相關(guān)模式分子(damage associated molecular patterns，DAMP)或警報(bào)蛋白，可被迅速釋放到細(xì)胞外，在炎癥、膿毒血癥、腫瘤、自身免疫性疾病及血管病變中起到非常重要的作用[2]。Toll樣受體(toll like receptor，TLR)9可特異性識別存在于細(xì)菌和病毒中的核酸序列，且其是識別細(xì)菌DNA中胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cytidine-phosphate-guanosine，CpG)模體的主要受體。TLR9可與特異性配體CpG相結(jié)合，激活先天免疫系統(tǒng)，參與缺血引發(fā)的炎癥反應(yīng)[3-4]。既往關(guān)于心肌梗死后組織修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可通過其受體TLR9參與傷口愈合和缺血后的血管生成[5]?；诖?，本研究觀察HMGB1和TLR9在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)變化，探討其在OIR發(fā)病機(jī)制中的作用及相關(guān)機(jī)制，旨在為ROP臨床藥物的開發(fā)提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器7日齡清潔級C57BL/6J小鼠30只，體質(zhì)量2.0～3.0 g，購自維通利華北京總公司。兔多克隆抗體HMGB1、β-actin購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔多克隆抗體TLR9(A14642)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，兔多克隆抗體TLR9(GB11266)、熒光二抗CY3標(biāo)記山羊抗兔(GB21303)、自發(fā)熒光淬滅劑(G0002)及眼球固定液購自武漢塞維爾生物科技有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，凝集素B4(isolectin B4，IB4)-594(Alexa Fluor 594-I21413)購自美國賽默飛世爾科技公司。智能控氧儀購自杭州艾普儀器設(shè)備有限公司，包埋機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司，正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司，共聚焦顯微鏡購自上海仁科生物有限公司，發(fā)光儀購自上海天能科技有限公司，TECAN多功能酶標(biāo)儀由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)精神研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及OIR模型建立將30只7日齡清潔級C57BL/6J小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為OIR組和對照組，每組15只。OIR組小鼠和哺乳母鼠放入含體積分?jǐn)?shù)(75±2)%氧氣的氧箱中飼養(yǎng) 5 d，每24 h更換一次哺乳母鼠，防止哺乳母鼠氧中毒死亡，5 d后將哺乳母鼠及小鼠重新放回正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。對照組小鼠和哺乳母鼠于正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2.2 視網(wǎng)膜鋪片法觀察小鼠視網(wǎng)膜血管分布及形態(tài)參考HE等[6]的方法進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片和染色。具體操作方法：每組小鼠于17日齡時(shí)隨機(jī)取3只，斷頭處死，取6只眼球置于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定30 min，刺破角膜再固定20 min，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗數(shù)次；用有齒鑷夾住角膜穿刺口，沿穿刺口剪開角膜(剪至鋸齒緣時(shí)，注意只剪外層鞏膜及色素膜)；一直延伸至視神經(jīng)處，用有齒鑷夾住兩側(cè)鞏膜，輕輕向兩邊撕開(注意不要撕爛視網(wǎng)膜)，小心去除晶狀體及玻璃體，留下視網(wǎng)膜，無齒鑷小心夾住鋸齒緣，以視盤為中心將視網(wǎng)膜剪為四葉草形狀。按說明書配制IB4-594溶液：500 g IB4粉末和500 μL 氯化鈣(1 mmol·L-1)制成重組凝集素，然后再加入49 mL氯化鈣(1 mmol·L-1)和500 mL 疊氮化鈉(200 mmol·L-1)，將剪裁好的視網(wǎng)膜放入500 mL配制好的IB4-594溶液中避光 4 ℃ 下過夜染色，PBS清洗數(shù)次后將視網(wǎng)膜內(nèi)層朝上平鋪于載玻片，吸水紙吸去水分，甘油明膠封片；共聚焦顯微鏡下觀察血管分布及形態(tài)變化。

1.2.3 免疫熒光染色檢測小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9蛋白表達(dá)每組小鼠于17日齡時(shí)隨機(jī)取4只，斷頭處死，取8只眼球置于40 g·L-1多聚甲醛固定，石蠟包埋，自視神經(jīng)處連續(xù)切片，每間隔6張取1張，切片厚度5 μm。將切片脫蠟，置于盛滿pH 6.0的檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。切片稍甩干后，使用組織化學(xué)筆在組織周圍畫圈并在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，牛血清白蛋白孵育30 min；滴加抗HMGB1一抗(滴度為1800)、TLR9一抗(GB11266)(滴度為1100)，4 ℃孵育過夜，然后使用PBS洗滌3次，滴加山羊抗兔熒光二抗(1300)，室溫下避光孵育50 min；再使用PBS洗滌3次，滴加二脒基苯基吲哚染液，室溫避光孵育10 min；PBS洗滌3次，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image J 軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.2.4 Western blot法檢測小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9蛋白表達(dá)小鼠于17日齡時(shí)每組隨機(jī)取3只，斷頭處死，摘取眼球，同“1.2.2”項(xiàng)方法完整分離視網(wǎng)膜，使用放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer,RIPA)冰上充分裂解組織，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min提取總蛋白，BCA法測總蛋白濃度，蛋白定量后加入上樣緩沖液煮沸；膠板灌注質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠，30 min后移入電泳槽，加電泳緩沖液，加樣孔加樣并電泳，電壓 80 V，待蛋白樣品通過濃縮膠進(jìn)入分離膠界面時(shí)，調(diào)至恒壓 120 V；冰盒內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒流300 mA，時(shí)間 90 min，結(jié)束后在聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上做好標(biāo)記，將PVDF膜放入脫脂牛奶中封閉2 h；滴加HMGB1一抗(滴度110 000)、TLR9一抗(A14642)(滴度11 000)和內(nèi)參β-actin(滴度15 000)，4 ℃孵育過夜，使用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；滴加HRP山羊抗兔IgG二抗(滴度15 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；11配制發(fā)光液，混勻后用錫箔紙包好避光，均勻滴在PVDF膜上，使用發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光并采集圖像，Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化結(jié)果見圖1。對照組小鼠視網(wǎng)膜完全血管化，自視盤中心向四周放射狀均勻分布，血管形態(tài)及走形正常。OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央處可見血管閉塞區(qū)，閉塞區(qū)周邊可見大量新生血管簇，視網(wǎng)膜血管走形迂曲。

A：對照組；B：OIR組；白色箭頭所指為新生血管族。

2.2 2組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9蛋白表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果比較結(jié)果見圖2和表1。對照組小鼠視網(wǎng)膜各層間結(jié)構(gòu)整齊，HMGB1蛋白呈紅色，主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，在內(nèi)核層及外核層可見少量表達(dá)(圖2A)；OIR組小鼠視網(wǎng)膜增厚，各層間結(jié)構(gòu)紊亂，組織緊密度降低，HMGB1蛋白呈紅色，在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層表達(dá)明顯增多(圖2B)。對照組小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白(紅色)主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層(圖2C)；OIR組小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白(紅色)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層的陽性表達(dá)增加(圖2D)。OIR組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR9蛋白熒光強(qiáng)度值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對照組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1蛋白表達(dá)；B：OIR組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1蛋白表達(dá)；C：對照組小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白表達(dá)；D：OIR組小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白表達(dá)。

表1 2組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9蛋白表達(dá)比較

2.3 2組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果比較結(jié)果見圖3和表2。HMGB1法蛋白印跡條帶表達(dá)于相對分子質(zhì)量約25 000 區(qū)域，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TLR9蛋白印跡條帶表達(dá)于相對分子質(zhì)量約125 000區(qū)域，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1:對照組；2：OIR組。

表2 2組小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

OIR小鼠模型是目前研究ROP應(yīng)用最廣泛的模型。STAHL等[7]研究表明，出生第7天的小鼠放入含體積分?jǐn)?shù)(75±2)%氧的高濃度氧箱中5 d后，小鼠的視網(wǎng)膜血管收縮，視網(wǎng)膜中央不成熟的毛細(xì)血管發(fā)生退行改變并導(dǎo)致中央?yún)^(qū)域血管閉塞，再次回歸室內(nèi)空氣時(shí)，中央?yún)^(qū)開始缺氧，炎癥因子、促進(jìn)血管增生因子上調(diào)，誘導(dǎo)病理性新生血管簇形成，而新生血管形成是OIR模型制備成功的主要標(biāo)志。本研究采用SMITH等[8]設(shè)計(jì)的方法建立OIR模型，結(jié)果顯示，對照組小鼠視網(wǎng)膜完全血管化，自視盤中心向四周放射狀均勻分布，血管形態(tài)及走形正常；OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央處可見血管閉塞區(qū)，閉塞區(qū)周邊可見大量新生血管簇，視網(wǎng)膜血管走形迂曲，說明OIR模型制備成功。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥與ROP病理性血管形成關(guān)系密切，炎癥與血管新生是2個(gè)相互聯(lián)系、共同發(fā)展的病理過程，持續(xù)的炎癥會(huì)損害組織的完整性[9]。炎癥誘導(dǎo)的血管生成不僅是急性感染或慢性炎癥性疾病中病原體防御的關(guān)鍵組成部分，還在修復(fù)機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[10]。HMGB1是一種高度保守的核染色質(zhì)結(jié)合蛋白，被認(rèn)為是重要的晚期炎癥因子，也是先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的早期預(yù)警信號，參與多種非感染性炎癥疾病(癌癥[11]、創(chuàng)傷[5]、自身免疫[12]等)的發(fā)病機(jī)制。本研究免疫熒光檢測結(jié)果顯示，OIR組小鼠視網(wǎng)膜增厚，各層間結(jié)構(gòu)紊亂，組織緊密度較正常視網(wǎng)膜減低，HMGB1蛋白在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層表達(dá)較對照組顯著增多；且Western blot檢測結(jié)果也顯示HMGB1蛋白表達(dá)較對照組顯著增高。HMGB1主要通過死亡細(xì)胞的被動(dòng)釋放和免疫活性細(xì)胞的主動(dòng)分泌進(jìn)入細(xì)胞外[2]。缺血、缺氧可導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷和死亡，被動(dòng)釋放HMGB1蛋白，死亡細(xì)胞引起炎癥刺激，激活免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1蛋白，釋放到細(xì)胞外的HMGB1可能以髓樣分化蛋白2依賴的方式與糖基化終末產(chǎn)物受體或TLR4結(jié)合，通過刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化直接參與血管生成，或者通過促使巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放促血管生成因子，間接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、萌芽[2,13]。已有研究報(bào)道，HMGB1除了可與RAGE、TLR4等結(jié)合調(diào)節(jié)血管生成，還可能通過TLR9發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成的作用[5]。

TLR是病原體識別受體家族，參與機(jī)體的固有免疫。TLR家族有11個(gè)成員，其中TLR9多表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、多囊泡體，主要結(jié)合細(xì)菌和病毒DNA中的非甲基化CpG DNA基序，對于預(yù)防自身免疫和不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)非常重要[14]。TLR9與不同配體結(jié)合后調(diào)控血管生成的作用也不同[5]。本研究中免疫熒光檢測結(jié)果顯示，OIR組小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度值高于對照組，TLR9主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層；且Western blot檢測結(jié)果也顯示，小鼠視網(wǎng)膜中TLR9蛋白相對表達(dá)量高于對照組。據(jù)此推測，OIR小鼠視網(wǎng)膜缺血缺氧、細(xì)胞受損死亡等引起炎癥反應(yīng)，使TLR9表達(dá)增高，激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，上調(diào)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、促血管生成因子的表達(dá)，進(jìn)而引起TNF-α及白細(xì)胞介素(interleukin，IL)類(如IL-6)表達(dá)增高，產(chǎn)生信號級聯(lián)反應(yīng)，從而參與視網(wǎng)膜新生血管形成[5,14-15]。

視網(wǎng)膜新生血管形成是眾多疾病如ROP、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)等發(fā)生的共同病理改變，這種血管與正常血管不同，其管壁薄弱，容易造成滲出、出血、增生等一系列病變，最終導(dǎo)致視力喪失。DR和ROP有著共同的致病基礎(chǔ)：缺氧和炎癥。在關(guān)于DR的研究中發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥是DR的重要病理機(jī)制，TLR9和HMGB1蛋白在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、外核層中均表達(dá)增加，認(rèn)為其參與DR的發(fā)生、發(fā)展[16]。這與本研究中OIR小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1、TLR9的表達(dá)變化類似。LIU等[5]研究顯示，心肌梗死和擴(kuò)張型心肌病小鼠心臟組織中TLR9表達(dá)增高，TLR9與HMGB1相互作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活、創(chuàng)傷愈合及心肌梗死后血管生成；心肌梗死模型中TLR9基因敲除小鼠病死率明顯增高，TLR9缺乏可消除HMGB1在心肌梗死后的保護(hù)作用。因此，認(rèn)為HMGB1和TLR9可單獨(dú)也可相互作用參與免疫應(yīng)答、創(chuàng)傷愈合及調(diào)節(jié)血管生成，促進(jìn)OIR的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，OIR小鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和TLR9表達(dá)顯著增高，其可能相互作用共同參與視網(wǎng)膜新生血管形成，促進(jìn)OIR的發(fā)生、發(fā)展。但二者具體存在怎樣的關(guān)系，通過哪些信號通路的變化促進(jìn)新生血管形成等機(jī)制仍不清楚，需要后續(xù)進(jìn)一步深入研究。