陳宇，武柳君，彭騰，熊秋韻，李夢(mèng)婷，陳胡蘭，謝曉芳▲，彭成▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137;2.西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137)

黃精養(yǎng)生飲是以中藥黃精為原料制備的保健功能食品，由成都中醫(yī)藥大學(xué)黃精產(chǎn)業(yè)研究所研發(fā)，由黃精、山藥等制備而成。黃精具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、益腎等功效，主治脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、內(nèi)熱消渴等[1]。山藥具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的功效，主治脾虛食少、久瀉不止、肺虛喘咳等[1]。黃精、山藥均是藥食兩用的補(bǔ)益類中藥[2]，應(yīng)用歷史悠久，為傳統(tǒng)養(yǎng)生保健佳品。研究表明，黃精、山藥都含有大量多糖類成分[3-4]，多糖為大多補(bǔ)益類中藥的主要活性成分，其恢復(fù)和促進(jìn)機(jī)體免疫功能的作用已得到了現(xiàn)代科學(xué)研究的廣泛證實(shí)[5-8]。由上推斷以黃精、山藥等為原料制成的黃精養(yǎng)生飲也可能具有調(diào)節(jié)免疫的功效。本研究采用正常小鼠和氫化可的松誘導(dǎo)的免疫低下模型小鼠進(jìn)行試驗(yàn)[9-10]，通過(guò)檢測(cè)特異性和非特異性免疫功能相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)黃精養(yǎng)生飲是否具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，為其進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(川)2015-30；豚鼠，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2015-030。實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都遵守成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

黃精養(yǎng)生飲，1 g生藥/mL，由成都中醫(yī)藥大學(xué)黃精產(chǎn)業(yè)研究所彭騰研究員制備，用雙蒸水配制成實(shí)驗(yàn)所需劑量，即5、2.5、1.25、0.625 g/kg；貞芪扶正膠囊(甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號(hào)：J20170208)，取12粒膠囊相當(dāng)于原生藥25 g用雙蒸水配制成5 g/kg；氫化可的松(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1811231)，臨用前用生理鹽水配制成40 mg/kg備用；墨汁；雞紅細(xì)胞懸液(自制)。

1.3 儀器

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(VARIOSKAN FLASH 2.4.3，美國(guó)Thermo公司)；電子分析天平(AL104，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-30R，美國(guó)Beckman)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 正常小鼠碳粒廓清試驗(yàn)[11-12]

取小鼠60只隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(雙蒸水)、貞芪扶正膠囊組(5 g/kg)、黃精養(yǎng)生飲4個(gè)劑量組(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每組10只。首次給藥前禁食不禁水12 h，各組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，稱重并灌胃給藥1次/d，連續(xù)給藥28 d。于末次給藥后禁食不禁水24 h，按0.1 mL/10 g尾靜脈注射生理鹽水稀釋4倍的墨汁(v/v)，于注射后第2 min(t1)、10 min(t2)分別用經(jīng)肝素鈉預(yù)處理的毛細(xì)管于眼后靜脈叢取血200 μL于盛有2 mL 0.1%碳酸鈉溶液的EP管中，吸入、吹出數(shù)次，混合均勻后吸取100 μL于96孔板內(nèi)，600 nm處測(cè)定并分別記錄吸光度值OD1、OD2。麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，解剖取脾臟、肝臟，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。按下列公式計(jì)算臟器指數(shù)和吞噬指數(shù)α。

臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%

K=(LogOD1-LogOD2)/(t2-t1)

α=體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×K1/3

2.2 氫化可的松致免疫功能低下試驗(yàn)[13]

2.2.1 血清溶血素的測(cè)定[14]

2.2.1.1 雞紅細(xì)胞懸液和補(bǔ)體的制備

雞紅細(xì)胞懸液制備：無(wú)菌操作，自雞翼下靜脈取血，置于100 mL疫苗瓶中，加 5 倍量Alsever液，搖勻，4℃冰箱儲(chǔ)存。臨用時(shí)，用生理鹽水洗滌3次，前兩次232×g離心5 min，棄上清液和界面的白細(xì)胞層，后連續(xù)兩次412×g離心5 min，直至血細(xì)胞比容恒定，按此值用生理鹽水配成 5% 雞紅細(xì)胞懸液。補(bǔ)體制備：3只豚鼠股動(dòng)脈抽血，取血清并混合，用生理鹽水稀釋成10%補(bǔ)體備用。

2.2.1.2 血清溶血素測(cè)定

取小鼠70只隨機(jī)分為七組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、貞芪扶正膠囊組(5 g/kg)、黃精養(yǎng)生飲4個(gè)劑量組(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每組10只。首次給藥前禁食不禁水12 h，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予雙蒸水灌胃，其于各組分別給予相應(yīng)藥物，稱重并灌胃1次/d，連續(xù)給藥10 d。給藥前30 min，正常對(duì)照組皮下注射生理鹽水，其余各組均皮下注射氫化可的松40 mg/kg造模，2天一次，共5次。另給藥第3天，各組小鼠0.2 mL/只腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液。末次給藥后禁食不禁水24 h，摘眼球取血0.5 mL后麻醉頸椎脫臼處死小鼠，取得的血1 860×g離心10 min，取血清20 μL，以0.9% NaCl稀釋血清100倍(v/v)，取稀釋血清1 mL與5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL、10%補(bǔ)體0.5 mL混合，空白管用生理鹽水代替血清，37℃恒溫孵育30 min后，放于4℃冰箱終止反應(yīng)；1 860×g離心10 min，取上清液300 μL于96孔板，540 nm處測(cè)定并分別記錄吸光度值。

2.2.2 遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)[15]

取小鼠70只隨機(jī)分為七組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、貞芪扶正膠囊組(5 g/kg)和黃精養(yǎng)生飲4個(gè)劑量組(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每組10只。首次給藥前禁食不禁水12 h，正常對(duì)照和模型對(duì)照組灌胃雙蒸水，其余各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，稱重并灌胃1次/d，連續(xù)10 d。給藥前30 min，正常對(duì)照組皮下注射生理鹽水，其余各組均皮下注射氫化可的松40 mg/kg造模，2天一次，共5次。于給藥第4天，將50 μL 1%二硝基氯苯丙酮麻油溶液均勻涂于面積約為9 cm2的小鼠腹部(剃刀除毛)，第2天同劑量同部位再?gòu)?qiáng)化1次致敏。末次給藥30 min后于小鼠右耳兩面涂1%二硝基氯苯丙酮麻油溶液20 μL/只進(jìn)行攻擊，攻擊24 h。麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，用直徑8 mm的打孔器于左右耳相同部位打下耳片，稱重，并以左右耳片的質(zhì)量差為腫脹度，比較各組小鼠的耳廓腫脹度。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 黃精養(yǎng)生飲對(duì)正常小鼠免疫功能的影響

由表1可知，給予黃精養(yǎng)生飲后，各劑量組小鼠在體質(zhì)量，肝臟、脾臟指數(shù)，吞噬指數(shù)α值上與正常對(duì)照組相比未見明顯差異。表明黃精養(yǎng)生飲對(duì)正常小鼠的免疫功能無(wú)明顯影響(見表1)。

表1 正常小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)、吞噬指數(shù)α

3.2 黃精養(yǎng)生飲對(duì)氫化可的松致小鼠免疫低下的影響

3.2.1 對(duì)血清溶血素的影響

與正常對(duì)照組相比，氫化可的松模型對(duì)照組小鼠血清溶血素水平降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，黃精養(yǎng)生飲各劑量組小鼠血清溶血素水平提高(P<0.01)，但在5 g/kg劑量下無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表2 免疫低下小鼠血清溶血素水平

3.2.2 對(duì)遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響

由表3可知，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的耳廓腫脹度明顯降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，黃精養(yǎng)生飲各劑量組小鼠耳廓腫脹度均有回升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 免疫低下小鼠耳廓腫脹度

4 討論

免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫活性物質(zhì)組成，包括中樞和外周免疫器官、淋巴細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞等[16]，發(fā)揮特異性免疫和非特異性免疫調(diào)節(jié)功能。免疫器官質(zhì)量可衡量免疫抑制狀態(tài)下機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，其中胸腺、脾臟、肝臟是重要的免疫器官，是衡量免疫功能的重要指標(biāo)[17]。單核巨噬細(xì)胞是非特異性免疫的重要組成部分，當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可迅速被其吞噬和清除，其吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一[18-19]。實(shí)驗(yàn)研究常用碳粒廓清法測(cè)定血液中碳粒的消失速度來(lái)反映單核巨噬細(xì)胞吞噬異物的能力[20]。本研究灌胃給予正常小鼠黃精養(yǎng)生飲，結(jié)果顯示在5 g/kg劑量下小鼠的體質(zhì)量、肝和脾的臟器指數(shù)及碳粒廓清吞噬指數(shù)有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明其對(duì)正常狀態(tài)下的免疫系統(tǒng)沒有嚴(yán)重影響，不會(huì)引發(fā)正常狀態(tài)下機(jī)體免疫功能的異常亢進(jìn)。

特異性免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫，是機(jī)體免疫防御的重要組成部分。血清溶血素的含量反映了B淋巴細(xì)胞增值及分化為漿細(xì)胞后分泌溶血素的能力，常用于評(píng)價(jià)機(jī)體的體液免疫功能[21]。本研究中，氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制模型小鼠血清溶血素水平降低，各劑量黃精養(yǎng)生飲均可使血清溶血素水平回升，表明黃精養(yǎng)生飲可增強(qiáng)免疫低下狀態(tài)下的體液免疫功能。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)常用于評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能，采用致敏抗原激活T淋巴細(xì)胞形成活化T淋巴細(xì)胞，當(dāng)活化T淋巴細(xì)胞再次與相應(yīng)致敏抗原接觸，兩者發(fā)生特異性結(jié)合并釋放出多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致局部組織發(fā)生以單核細(xì)胞浸潤(rùn)和變性壞死為主要特征的炎癥反應(yīng)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組相比，黃精養(yǎng)生飲在一定程度上能增加小鼠的耳腫脹度，反映其對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)具有一定的刺激作用，表明黃精養(yǎng)生飲可增強(qiáng)免疫低下小鼠細(xì)胞免疫功能。

本實(shí)驗(yàn)初步探索了黃精養(yǎng)生飲對(duì)正常小鼠和免疫低下模型小鼠免疫功能的影響，結(jié)果顯示其對(duì)正常小鼠的免疫功能有一定程度的增強(qiáng)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而同劑量下可增強(qiáng)免疫低下小鼠的血清溶血素水平、提高T淋巴細(xì)胞活性，顯示出提升體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。給藥期間，小鼠無(wú)其它不良反應(yīng)或不適表現(xiàn)。研究表明，黃精養(yǎng)生飲作為一種增強(qiáng)免疫功能的功能飲品作用溫和有效且安全。