李露露，宋圓英，胡馨予，盧云

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610075)

腦梗死(Cerebral Infarction，CI)又稱缺血性腦卒中，是因腦部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致腦組織局限性缺血、缺氧壞死，使機(jī)體出現(xiàn)偏癱、失語(yǔ)、認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)功能缺損癥狀，具有病死率、致殘率、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是危害人類健康的重大疾病之一[1]。世界衛(wèi)生組織2015年發(fā)布的全球非傳染性疾病狀況報(bào)告中指出，每年約1 750萬人死于非傳染性疾病，其中約670萬人死于中風(fēng)[2]。目前西醫(yī)對(duì)該病的治療以對(duì)癥治療為主，包括降壓、降脂、抗凝、抗血小板聚集、抗炎和營(yíng)養(yǎng)支持等，但部分患者治療效果不佳。近年來，隨著對(duì)中醫(yī)藥研究的不斷深入，中西醫(yī)結(jié)合治療方式在改善腦梗死患者神經(jīng)功能，減輕其臨床癥狀等方面發(fā)揮了重要作用[3]。

中醫(yī)認(rèn)為CI屬于“中風(fēng)病”范疇，以元?dú)馓澨摓楸?，虛、瘀、痰、火、風(fēng)夾雜，最終導(dǎo)致機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)、氣血逆亂[4]。中醫(yī)藥在CI治療中發(fā)揮著重要作用[5]，藥對(duì)作為方劑組成核心部分是復(fù)方藥理研究的重要內(nèi)容，惠小珊等[4]在對(duì)腦梗死中藥復(fù)方專利用藥配伍規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，丹參-川芎是其中最常用的藥對(duì)。丹參味苦，性微寒，功能活血止痛、祛瘀生新、除煩安神；川芎味辛，性溫，功能活血行氣、祛風(fēng)止痛[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參提取物可透過血腦屏障，發(fā)揮抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)血管再生等作用[7]；川芎提取物可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路的激活發(fā)揮對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用[8]。該藥對(duì)發(fā)揮治療效果的具體作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接機(jī)制研究丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死的關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為日后的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩選丹參-川芎藥對(duì)有效成分及其作用靶點(diǎn)

分別以“丹參”“川芎”為搜索詞在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中進(jìn)行檢索，設(shè)置生物口服利用度(OB)≥30%、化合物類藥性(DL)≥0.18為閾值，得到丹參、川芎有效成分。在Related Targets列表下獲取整理有效成分作用靶點(diǎn)，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的靶點(diǎn)名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，獲取其簡(jiǎn)稱。

1.2 篩選獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)

以“cerebral infarction”為檢索詞，在GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，去除重復(fù)項(xiàng)獲得與腦梗死相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 獲取藥物和疾病共同靶點(diǎn)并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

繪制韋恩圖得到藥物和疾病共同作用靶點(diǎn)，使用cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。在String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入二者共有的靶蛋白，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，其中“Homo sapiens”為蛋白種屬、“medium confidence>0.4”為相互作用閾值。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體(GO)生物學(xué)功能過程分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，設(shè)置P<0.5為閾值，可視化處理后分析丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死可能涉及的分子功能和信號(hào)通路。

1.5 分子對(duì)接

利用AutoDock Vina軟件對(duì)丹參-川芎藥對(duì)三個(gè)主要成分MOL000006(Luteolin,木犀草素)、MOL007154(Tanshinone iia,丹參酮ⅡA)、MOL007088(Cryptotanshinon，隱丹參酮)和核心靶點(diǎn)EGFR、MYC、VEGFA進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，從而驗(yàn)證其相互間的作用活性。首先在TCMSP軟件上下載主要化合物的結(jié)構(gòu)文件，從PDB網(wǎng)站(http://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)蛋白的pdb文件，利用AutoDock Tools對(duì)上述配體和受體進(jìn)行常規(guī)處理，利用Autogrid得到對(duì)接活性位點(diǎn)，用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能(Affinity)。查閱大量文獻(xiàn)，以結(jié)合能≤-5 kJ/mol為分子與靶點(diǎn)結(jié)核性較好的篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能越小對(duì)接越好[9-11]。

2 結(jié)果

2.1 丹參-川芎藥對(duì)有效成分及其作用靶點(diǎn)

設(shè)置閾值OB≥30%，DL≥0.18后，共篩選出丹參-川芎藥對(duì)有效成分72種，其中丹參65種，川芎7種，具體內(nèi)容見表1。

表1 丹參-川芎藥對(duì)有效成分

2.2 藥物有效成分和疾病共同靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)篩選獲取藥物有效成分靶點(diǎn)61個(gè)，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共獲取疾病相關(guān)靶點(diǎn)3 110個(gè)，將藥物有效成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，得到共同作用靶點(diǎn)47個(gè)，具體內(nèi)容見表2。利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖1)，共包含105個(gè)節(jié)點(diǎn)和397條邊。利用中心度值(Betweenness Centrality)和等級(jí)值(Degree)進(jìn)行排序，得到排名靠前的化合物分別為MOL000006(luteolin,木犀草素)、MOL007154(tanshinone iia,丹參酮ⅡA)、MOL007088(cryptotanshinone,隱丹參酮)、MOL007049(4-methylenemiltirone，4-亞甲丹參新酮)和MOL007100(dihydrotanshinlactone,二氫丹參內(nèi)酯)。通過string數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置相互作用閾值為中等(medium confidence>0.4)，得到47個(gè)節(jié)點(diǎn)和311條互作邊(圖2)。使用R軟件繪制Barplot條形圖進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)排名靠前的作用靶點(diǎn)是EGFR、MYC、VEGFA、GASP3、IL6等(見圖3，其中左列為基因名，如EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生長(zhǎng)因子受體；數(shù)字為相應(yīng)基因臨近節(jié)點(diǎn)數(shù)目，如EGFR相應(yīng)節(jié)點(diǎn)數(shù)目為29)。

圖3 丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死互作關(guān)系barplot圖

表2 丹參-川芎藥對(duì)和腦梗死47個(gè)共同作用靶點(diǎn)

圖1 丹參-川芎藥對(duì)有效成分-疾病靶點(diǎn)圖

圖2 丹參-川芎藥對(duì)潛在靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO和KEGG富集分析結(jié)果

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(P<0.05)，進(jìn)行GO功能富集分析，得到生物過程(Biological Process，BP)條目426個(gè)，細(xì)胞組成(Cell Composition，CC)條目45個(gè)，分子功能(Molecular Function，MF)條目52個(gè)。按P值排序?qū)⑶?0條繪圖表示，其中點(diǎn)越大表示富集基因數(shù)越多，顏色越紅表示藥物對(duì)疾病的干預(yù)越密切，主要涉及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異類固醇正調(diào)控、核受體活性、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性等分子功能和生物過程(圖4)。對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到31條信號(hào)通路，按P值排序?qū)⑶?0條繪圖表示，主要涉及PI3K-AKT、TNF、AGE-RAGE以及癌癥等通路(圖5)。

圖4 GO功能分析氣泡圖(前20)

圖5 KEGG通路分析氣泡圖(前20)

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

使用AutoDock Vina軟件對(duì)丹參-川芎藥對(duì)中排名前三的活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)EGFRA、MYC、VEGF進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)合能小于0表明藥物分子和靶點(diǎn)能夠發(fā)生結(jié)合，結(jié)合能小于≤-5 kJ/mol表明分子與靶點(diǎn)結(jié)合性較好，結(jié)合能越小則對(duì)接越好[9-11]。對(duì)接結(jié)果表明藥物主要有效成分luteolin(木犀草素)、tanshinone iia(丹參酮ⅡA)、cryptotanshinone(隱丹參酮)與核心靶點(diǎn)EGFR、MYC、VEGF之間結(jié)合性較好，具體對(duì)接結(jié)果見表3。圖6～8為對(duì)接最好的組合，包括luteolin和MYC、tanshinone iia和VEGFA、4-methylenemiltirone和VEGFA。其中l(wèi)uteolin與MYC活性位點(diǎn)TYR-295、GLU-321、ASN-332、THR-337形成氫鍵作用，tanshinone iia與VEGFA活性位點(diǎn)ASP-276、LYS-286形成氫鍵作用，cryptotanshinone與EGFR活性位點(diǎn)VAL-34、TYR-36、CYS-32形成氫鍵作用，這些氫鍵是促進(jìn)結(jié)合到活性位點(diǎn)的主要作用力[12]。

圖6 MYC和luteolin

表3 核心蛋白與化合物對(duì)接結(jié)果

3 討論

腦梗死在腦血管病中占據(jù)重要組成部分，丹參、川芎作為活血行氣、祛瘀生新的常用中藥，在腦梗死的治療中被廣泛運(yùn)用。丹參的水溶性提取物丹參多酚酸、復(fù)方制劑丹參川芎嗪等更是在腦梗死治療中效果顯著。目前，大量研究顯示丹參-川芎藥對(duì)能夠改善腦組織缺血、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管神經(jīng)再生，在改善患者預(yù)后方面發(fā)揮著顯著作用[13-16]。

本次研究中藥物有效成分和疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示，丹參-川芎藥對(duì)的主要成分木犀草素(luteolin)、丹參酮ⅡA (tanshinone iia)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、4-亞甲丹參新酮(4-methylenemiltirone)和二氫丹參內(nèi)酯(dihydrotanshinlactone)是網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)，提示這些化合物在丹參-川芎藥對(duì)中發(fā)揮治療腦梗死的重要作用。

研究表明，木犀草素作為一種天然存在的四羥基黃酮化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、保護(hù)血腦屏障通透性等作用[17-19]。其抗炎機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路激活從而降低促炎介質(zhì)一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生發(fā)揮作用[20-21]，最近的研究還發(fā)現(xiàn)木犀草素通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，并減少梗死體積[22]。丹參酮ⅡA是丹參中發(fā)現(xiàn)的一種親脂性化學(xué)物質(zhì)，既往的研究證實(shí)其對(duì)局灶性腦缺血和局灶性腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，能夠擴(kuò)張腦血管、改善微循環(huán)、減少梗死灶面積，從而實(shí)現(xiàn)改善腦梗死導(dǎo)致的腦功能代謝障礙[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠上調(diào)梗死區(qū)Bal-2蛋白水平并下調(diào)Bax蛋白水平，發(fā)揮抗凋亡作用，并且能抑制梗死區(qū)海馬和皮質(zhì)中IL-6、TNF-α、CRP水平以減輕炎癥反應(yīng)[26]。目前常用的丹參酮ⅡA磺酸鈉(STS)能夠減弱自噬相關(guān)蛋白LC3-11、Beclin-1和Sirt的上調(diào)水平，從而發(fā)揮減輕神經(jīng)炎癥、改善神經(jīng)功能缺損的保護(hù)作用[27]。隱丹參酮是丹參中的脂溶性提取物，可透過血腦屏障干預(yù)β淀粉樣蛋白所形成的腦損害，還能夠通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡細(xì)胞信號(hào)途徑發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并且其提高線粒體膜電位、抑制細(xì)胞毒性的功能實(shí)現(xiàn)和PI3K-Akt信號(hào)通路密切相關(guān)[28]。在對(duì)缺血/再灌注大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可降低損傷大鼠神經(jīng)功能缺損行為學(xué)評(píng)分，減少腦梗死體積，通過抑制Caspase-3、miR-210表達(dá)上調(diào)來實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞凋亡、減少超氧化物產(chǎn)生的功能[29]。以上結(jié)果說明丹參-川芎藥對(duì)的主要成分可以通過多種途徑相互協(xié)同在腦梗死的治療中發(fā)揮作用，目前關(guān)于4-亞甲丹參新酮在治療腦梗死的研究中還很少得到報(bào)道，值得未來研究對(duì)其進(jìn)行關(guān)注。

通過匹配藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)得出丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死相關(guān)靶點(diǎn)47個(gè)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)EGFR、MYC、VEGFA、GASP3、IL6這五個(gè)靶點(diǎn)在治療網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位，表明其可能是丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死的重要靶點(diǎn)。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因和細(xì)胞增殖、代謝密切相關(guān)，當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)與其結(jié)合時(shí)，EGFR被激活參與MAPK家族和PI3K/Akt信號(hào)通路傳導(dǎo)，影響細(xì)胞存活循環(huán)周期，從而在腦梗死后的神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用[30-31]。研究顯示促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)發(fā)生可以改善神經(jīng)功能預(yù)后，減輕病情，而EGFR在調(diào)控腦梗死后室管膜下區(qū)(SVZ)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖和分化、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生過程中至關(guān)重要[32],但其具體機(jī)制尚不明確。MYC基因是較早發(fā)現(xiàn)的一組類癌基因，包括C-myc、N-myc、L-myc，其中N-myc下游調(diào)控基因(NDRG)家族成員在應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、腫瘤基因調(diào)控中扮演重要角色[33]，其家族成員NDRG1可能通過Raf-ERK通路促進(jìn)缺氧細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其應(yīng)對(duì)缺氧的時(shí)長(zhǎng)，從而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用[34]。NDRG2在星形膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，具有穩(wěn)定血腦屏障、傳遞神經(jīng)突觸間信息、調(diào)節(jié)腦血流量等重要生理功能[35]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)作為眾所周知的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)靶基因，是促進(jìn)血管新生的一個(gè)重要調(diào)節(jié)基因[36]。通過與其受體VEGFR2結(jié)合，能夠經(jīng)Ras/MAPK途徑傳導(dǎo)，刺激細(xì)胞內(nèi)皮增殖、遷移并維持細(xì)胞活性[37]。研究表明，在短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞的急、慢性期，VEGFA能通過上調(diào)腦缺血再灌注損傷后缺血區(qū)血管性血友病因子水平，促進(jìn)血液循環(huán)從而改善腦梗死后的神經(jīng)功能缺損癥狀[38]。本研究顯示丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)集中在對(duì)血管生成的調(diào)控作用上，提示其治療作用和促進(jìn)腦組織血管生成、改善缺血區(qū)血流供應(yīng)密切相關(guān)。值得注意的是，研究還顯示治療靶點(diǎn)和癌癥關(guān)系密切，癌癥在中醫(yī)屬癥瘕積聚的范疇，腦梗死本質(zhì)上屬氣虛血瘀致有形之塊聚集，和癌癥有共通之處，中醫(yī)“異病同治”的思想得以體現(xiàn)。

圖7 VEGFA和tanshinone iia

圖8 EGFR和cryptotanshinone

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死主要涉及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異類固醇正調(diào)控、核受體活性、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性等分子功能和生物過程，這些生物學(xué)過程在藥物治療腦梗死的機(jī)制通路中都有所體現(xiàn)。關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于PI3K-AKT信號(hào)通路[21]、TNF信號(hào)通路[39]以及一些癌癥通路等。其中病毒感染的通路涉及Caspase-3 和 NF-κB，可對(duì)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用[9,40]；PI3K-AKT信號(hào)通路富集效果明顯，提示其可能是丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死的核心通路，值得重點(diǎn)進(jìn)行研究。先前各實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)川芎具有較強(qiáng)的擴(kuò)血管、改善循環(huán)、減輕神經(jīng)元損傷的作用[41]，周蕙芬等[42]在丹參-川芎藥對(duì)的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)其能夠抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的增加。以上研究結(jié)論和本次網(wǎng)絡(luò)藥理的結(jié)果具有一致性，表明此次研究結(jié)果較為可靠。GO和KEGG富集分析的結(jié)果表明丹參-川芎藥對(duì)的活性成分通過多種途徑發(fā)揮治療腦梗死的作用，這些通路和通路之間的協(xié)同關(guān)系都可以為以后的研究提供方向。分子對(duì)接結(jié)果顯示，丹參-川芎藥對(duì)的活性成分與MYC、EGFR、VEGFR的親和力較好，其化合物對(duì)疾病治療的有效性仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死的作用機(jī)制進(jìn)行探究，認(rèn)為其可能通過促進(jìn)血管生成、抗細(xì)胞凋亡、抗炎等途徑改善梗死區(qū)神經(jīng)功能缺損情況，為了解丹參-川芎藥對(duì)治療腦梗死的機(jī)制提供了理論依據(jù)?？紤]到基于網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析的局限性以及藥物在煎煮過程中的互相作用，目前結(jié)果可為后續(xù)研究提供參考方向，但是具體的結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。