陳 潔， 瞿雅懿， 何金曉， 蔡曉洋， 萬子玉， 陳華林， 李 敏

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 四川 成都 611137)

種子種苗是中藥材種植的源頭，優(yōu)良的種子種苗是優(yōu)質(zhì)中藥材生產(chǎn)的基礎(chǔ)[1-2]。中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)化是中藥材規(guī)范化生產(chǎn)的主要推動(dòng)力和保障，但我國中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)化研究尚處于初步階段[3-4]。目前中藥材種子種苗的國家標(biāo)準(zhǔn)有5項(xiàng)，僅有人參、三七種子種苗納入國際標(biāo)準(zhǔn)。中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)化研究方面有大量關(guān)于種子質(zhì)量分級的研究[5-10]，而針對無性繁殖材料(如種莖、種根)的相關(guān)研究較少，但半夏、魚腥草、附子等[11-13]中藥材已有文獻(xiàn)報(bào)道。

黃絲郁金為姜科姜黃屬植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥塊根[14]，主產(chǎn)于四川省金馬河和羊馬河流域及樂山犍為等地區(qū)[15]。黃絲郁金采用無性繁殖，繁殖器官為根莖，用于播種的根莖稱為種姜。種姜是黃絲郁金藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其分級與藥材產(chǎn)量、質(zhì)量的穩(wěn)定性密切相關(guān)。然而，針對黃絲郁金種姜分級方面的研究鮮有報(bào)道，亦無標(biāo)準(zhǔn)可依。前期產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，藥農(nóng)使用的黃絲郁金種姜多為側(cè)根莖，大小不一，種姜質(zhì)量參差不齊，植株生長差異大，導(dǎo)致藥材產(chǎn)量與質(zhì)量均不穩(wěn)定，難以保障其臨床療效。因此，亟待開展黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)研究，以期從源頭上保障其藥材產(chǎn)量與質(zhì)量。

鑒于此，本研究通過測定并分析黃絲郁金種姜的凈度、種姜粗、種姜重、種姜長、含水量、發(fā)芽率等質(zhì)量指標(biāo)，初步劃分種姜等級，然后開展不同等級種姜田間驗(yàn)證試驗(yàn)，分析各級種姜的植株生長情況、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)指標(biāo)，最終建立黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)，為黃絲郁金種姜及藥材的規(guī)范化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，也為種姜分級標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)樣品

2017年在郁金道地產(chǎn)區(qū)與主產(chǎn)區(qū)收集黃絲郁金種姜17份，詳情見表1。種姜樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為姜黃(CurcumalongaL.)的新鮮根莖。

表1 黃絲郁金種姜樣品信息

1.2 儀器與試劑

Agilent 1200 HPLC高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DUG-9070 B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SQP萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；KQ-500 DE型超聲波清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；JJ 200型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；姜黃素(四川省維科奇生物科技有限公司提供，批號：wkq16071501，純度≥98.0%)；水為蒸餾水；甲醇、無水乙醇、冰醋酸均為分析純；色譜乙腈、色譜甲醇。

2 方 法

2.1 種姜分級方法

根據(jù)前期研究結(jié)果[16]，黃絲郁金種姜以子姜(側(cè)根莖)播種為宜，郁金產(chǎn)量最佳；而母姜(直根莖)作為種姜，郁金產(chǎn)量低，不適宜作為黃絲郁金種姜來源，因此本研究不納入直根莖。對17份種姜樣品的凈度、種姜粗、種姜重、種姜長、含水量、發(fā)芽率指標(biāo)進(jìn)行測定，采用Excel 2016軟件和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。運(yùn)用描述統(tǒng)計(jì)、偏相關(guān)分析和方差分析篩選初步分級指標(biāo)，根據(jù)K-中心聚類分析得到的聚類中心值劃分種姜等級。再根據(jù)各級種姜含水量及發(fā)芽率測定結(jié)果，最終確定分級指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，建立黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.1凈度分析

采用隨機(jī)取樣法，每份稱取種姜2.00 kg，將樣品中的完整種姜、殘缺種姜(包括蟲蛀、腐爛、霉變)、其他雜質(zhì)物(包括植物的非藥用部位、泥土或砂石)挑選出來，稱重，重復(fù)3次，按以下公式計(jì)算凈度。

凈度(%)=[凈種姜重量/(凈種姜重量+殘缺種姜+其他雜質(zhì)物)]×100%。

2.1.2種姜粗、種姜重及種姜長測定

每份隨機(jī)取凈種姜1.00 kg，測定種姜粗、種姜長、種姜重。種姜粗為種姜的橫直徑(種姜中間最粗的部位)，精確到0.01 mm；種姜長為用游標(biāo)卡尺測量種姜縱直徑(種姜的長度)，精確到0.01 mm；種姜重用電子天平稱量其重量，精確到0.01 g。

2.1.3含水量測定

每份隨機(jī)取大小均勻的凈種姜1.00 kg，切碎(姜塊直徑約1 cm)，精確稱取試驗(yàn)樣品約20.00 g，將其放入預(yù)先達(dá)到恒重的樣品盒內(nèi)，稱重。然后將樣品放入烘箱內(nèi)，控制烘箱溫度保持在(103±2)℃，烘4 h，取出放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱重，重復(fù)3次。根據(jù)烘干后減少的重量，計(jì)算種姜含水量。

含水量(%)=[(樣品烘干前重量-樣品烘干后重量)/樣品烘干前重量]×100%。

2.1.4發(fā)芽率測定

每份隨機(jī)取大小均勻的凈種姜1.00 kg，將種姜切成長度為2～3 cm的姜塊，取50個(gè)種姜姜塊，重復(fù)3次。發(fā)芽床為砂床，將種姜姜塊置于砂間，均勻間隔，放在保濕的發(fā)芽盆內(nèi)，控制環(huán)境溫度保持在(25±2)℃，相對濕度為60%。于第7天開始計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)50個(gè)種姜姜塊的發(fā)芽數(shù)(發(fā)芽的判定標(biāo)準(zhǔn)為每個(gè)姜塊的芽長大于3 cm)，記錄各處理發(fā)芽情況，直至第25天種姜不再發(fā)芽。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽姜塊數(shù)/姜塊總數(shù))×100%。

2.2 田間驗(yàn)證試驗(yàn)方法

2.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選無病蟲害的各級種姜，包括等外級種姜(即種姜粗或種姜重不符合最低要求的種姜)，開展大田試驗(yàn)。試驗(yàn)小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3次重復(fù)。小區(qū)面積為15 m2，各小區(qū)間設(shè)置1 m隔離行。田間管理措施同一般大田栽培。

2.2.2植株生長指標(biāo)測定

待植株苗齊后，采用S型取樣法隨機(jī)在每個(gè)小區(qū)選定10株植株，分別在苗期、葉叢期、塊根膨大期各測定一次。測定株高(即頂端葉片到植株根莖基部的距離)、葉長、葉寬；測定莖粗(即測量距根基處約2 cm的最大莖粗)，記錄葉片數(shù)(枯萎面積達(dá)50%以上的葉片不納入計(jì)數(shù))。

2.2.3藥材產(chǎn)量測定

采收時(shí)將各處理小區(qū)的黃絲郁金分別采挖，去掉須根和雜質(zhì)，洗凈泥土，蒸煮后烘干，稱重，統(tǒng)計(jì)各小區(qū)藥材產(chǎn)量。

2.2.4藥材商品等級占比

采用四分法取各小區(qū)所產(chǎn)黃絲郁金藥材1.00 kg，基于課題組前期研究制定的郁金藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)將其分為一、二等，統(tǒng)計(jì)各等級藥材的重量與粒數(shù)占比。

2.2.5浸出物測定

參照《中國藥典》2015年版(以下簡稱藥典)四部通則2201醇溶性浸出物測定法進(jìn)行測定[14]。

2.2.6揮發(fā)油含量測定

參照藥典四部通則2204揮發(fā)油測定法甲法進(jìn)行測定[14]。

2.2.7姜黃素含量測定

參照藥典一部姜黃藥材含量測定項(xiàng)下方法進(jìn)行測定[14]。

3 結(jié)果與分析

3.1 種姜分級

3.1.1種姜凈度

17份黃絲郁金種姜的凈度測定結(jié)果見表2，其凈度為94.70%～98.35%，平均值為96.72%。其中有14份種姜凈度≥96.00%，占比為82.35%。故建議黃絲郁金種姜凈度≥96.00%。

表2 黃絲郁金種姜凈度測定結(jié)果

3.1.2種姜粗、種姜重及種姜長

對17份黃絲郁金種姜的種姜粗、種姜重、種姜長3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測定及分析，結(jié)果見表3～表6。根據(jù)描述性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知(表3)，黃絲郁金種姜長的方差遠(yuǎn)大于種姜粗和種姜重，說明其種姜長的離散程度最大，變異大，可控性低。因此，將種姜粗和種姜重作為黃絲郁金種姜初步分級指標(biāo)。運(yùn)用偏相關(guān)分析方法，探究黃絲郁金種姜粗、種姜重、種姜長三者之間的相關(guān)性，其結(jié)果見表4，結(jié)果表明，當(dāng)控制種姜長的影響后，種姜粗與種姜重呈顯著性正相關(guān)(p<0.01)。并且在生產(chǎn)上，種姜重和種姜粗是反映種姜質(zhì)量的重要指標(biāo)，進(jìn)一步說明將種姜粗、種姜重作為黃絲郁金種姜初步分級指標(biāo)的合理性。

表3 黃絲郁金種姜指標(biāo)的描述

表4 黃絲郁金種姜指標(biāo)偏相關(guān)分析(n=1645)

以種姜粗、種姜重這2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行方差分析，由表5可知，種姜粗、種姜重在各類別間有顯著性差異(p<0.01)。由各聚類中心值來看，黃絲郁金種姜聚為3類，每類種姜粒數(shù)占比為13.92%、34.35%、51.73%，見表6。通過對各聚類中心值取整，得到各級種姜的臨界值，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)行調(diào)整，將黃絲郁金種姜初步分為三個(gè)等級：一級種姜種姜的粗≥16 mm，種姜重≥10 g；二級種姜的種姜粗≥12 mm，種姜重≥6 g；三級種姜的種姜粗≥8 mm，種姜重≥3 g。

表5 黃絲郁金種姜初步分級指標(biāo)的方差分析結(jié)果

表6 黃絲郁金種姜初步分級指標(biāo)的最終聚類中心

3.1.3種姜含水量

根據(jù)上述初步分級指標(biāo)將黃絲郁金種姜分為三個(gè)等級，測定黃絲郁金各級種姜含水量，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，黃絲郁金一、二、三級種姜含水量范圍分別為59.61%～79.65%、74.41%～84.54%、70.17%～82.62%，含水量平均值分別為73.28%、79.44%、77.79%。其中15份一級種姜含水量≥70.00%，占比88.24%；14份二級種姜含水量≥75%，占比82.35%；15份三級種姜含水量≥75.00%，占比88.24%。因此，將黃絲郁金種姜含水量擬定為一級種姜≥70.00%<75.00%，二級和三級種姜≥75.00%。

表7 黃絲郁金各級種姜含水量結(jié)果

3.1.4種姜發(fā)芽率

黃絲郁金各級種姜發(fā)芽率測定結(jié)果見表8。黃絲郁金一、二、三級種姜發(fā)芽率范圍分別為98.00%～100.00%、96.00%～98.67%、93.33%～96.67%，平均值分別為99.67%、97.00%、94.67%。其中13份一級種姜發(fā)芽率≥99.00%，占比76.47%；11份二級種姜發(fā)芽率≥97.00%，占比64.70%；15份三級種姜發(fā)芽率≥94.00%，占比88.24%。因此，將黃絲郁金種姜發(fā)芽率擬定為一級種姜≥99.00%，二級種姜≥97.00%，三級種姜≥94.00%。

表8 黃絲郁金各級種姜發(fā)芽率結(jié)果

3.1.5種姜分級標(biāo)準(zhǔn)的建立

根據(jù)以上結(jié)果選擇種姜粗、種姜重、發(fā)芽率為主要分級指標(biāo)，含水量、凈度作為次要分級指標(biāo)，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，初步建立黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)，見表9。分級方法采用最低定級原則，即任何一項(xiàng)指標(biāo)不符合規(guī)定都不能作為相應(yīng)等級的種姜。

表9 黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)

3.2 種姜分級標(biāo)準(zhǔn)的田間驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1黃絲郁金各級種姜植株生長情況

黃絲郁金植株在不同生長期的株高、葉片數(shù)、葉長、葉寬及莖粗的測定結(jié)果見表10。隨著黃絲郁金植株的生長，不同生長期的各級種姜植株生長指標(biāo)之間的關(guān)系不一致。苗期時(shí)，僅有一級種姜的株高、葉長與其他各級種姜有顯著性差異(p<0.05)，葉片數(shù)、莖粗均無顯著性差異(p>0.05)；葉叢期時(shí)，一、二級種姜植株的株高、葉片數(shù)、葉長、葉寬無顯著性差異(p>0.05)，但與其他各級種姜之間有顯著性差異(p<0.05)，而莖粗在一、二、三級之間均有顯著性差異(p<0.05)，等外級與三級種姜之間無顯著性差異(p>0.05)；塊根膨大期時(shí)，各級種姜植株的株高、葉長均呈一級種姜>二級種姜>三級種姜>等外級種姜；一、二級種姜的葉寬顯著(p<0.05)高于三級和等外級種姜，而一級種姜的葉片數(shù)、二級種姜的莖粗顯著(p<0.05)高于其他各級種姜。

表10 黃絲郁金植株主要生長指標(biāo)測定結(jié)果

3.2.2黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量

黃絲郁金不同等級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量測定結(jié)果，見表11。由表可知，一、二、三級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量與等外級種姜有顯著性差異(p<0.05)。黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量大小為一級種姜>二級種姜>三級種姜>等外級種姜，其中一、二、三級種姜分別高出等外級種姜71.01%、43.69%、39.22%，呈種姜等級越高所產(chǎn)藥材產(chǎn)量越高的趨勢。

表11 黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量結(jié)果

3.2.3黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材商品等級占比

根據(jù)前期研究結(jié)果，將黃絲郁金藥材分為一、二等，其商品等級的重量和粒數(shù)占比結(jié)果見表12。分析可知，各級種姜所產(chǎn)一等藥材的重量占比大小為一級種姜>二級種姜>三級種姜>等外級種姜，其中一級種姜所產(chǎn)一等藥材的重量占比顯著高于三級和等外級種姜(p<0.05)；各級種姜所產(chǎn)一等藥材的粒數(shù)占比大小為一級種姜>三級種姜>二級種姜>等外級種姜，其中一級種姜所產(chǎn)一等藥材的粒數(shù)占比顯著高于等外級種姜(p<0.05)。說明種姜分級種植可提高一等藥材的比例，有利于提高經(jīng)濟(jì)效益。

表12 黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材商品等級的重量與粒數(shù)占比結(jié)果

3.2.4黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材質(zhì)量

黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材質(zhì)量結(jié)果見表13。據(jù)表可知，一、二、三級種姜所產(chǎn)藥材浸出物顯著高于等外級種姜對應(yīng)藥材(p<0.05)；而各級種姜所產(chǎn)藥材的揮發(fā)油、姜黃素含量均無顯著性差異(p>0.05)，但總體趨勢表現(xiàn)為一、二、三級種姜高于等外級種姜。

表13 黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材質(zhì)量結(jié)果

4 結(jié)論與討論

本研究分析了17份黃絲郁金種姜的凈度、種姜粗、種姜重、種姜長、含水量、發(fā)芽率指標(biāo)，運(yùn)用K-中心聚類分析等方法，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將黃絲郁金種姜分為三個(gè)等級，初步建立黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)。然后進(jìn)行田間驗(yàn)證試驗(yàn)，于苗期、葉叢期、塊根膨大期分別測定黃絲郁金各級種姜的植株生長指標(biāo)，結(jié)果顯示，隨著植株的生長發(fā)育，株高、葉長之間差異越顯著。于采收期測定黃絲郁金各級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量、質(zhì)量指標(biāo)，結(jié)果表明，一、二、三級種姜所產(chǎn)藥材產(chǎn)量與等外級種姜存在顯著性差異(p<0.05)，且一級種姜產(chǎn)出藥材產(chǎn)量較等外級種姜高71.01%；一、二、三級種姜所產(chǎn)藥材浸出物顯著高于等外級種姜(p<0.05)。此外，一級種姜所產(chǎn)一等藥材的重量與粒數(shù)占比均最高。綜上所述，不同等級種姜在植株生長、藥材產(chǎn)量與質(zhì)量方面均存在差異，可見本研究建立的黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)可行。并且，種姜分級種植有利于提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，還能提高一等藥材的比例以增加經(jīng)濟(jì)效益，為實(shí)現(xiàn)黃絲郁金種姜及藥材的規(guī)范化生產(chǎn)提供支撐。

種姜粗和種姜重是反映黃絲郁金種姜質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，種姜長的離散程度較大，變異大，而控制種姜長后，種姜粗與種姜重呈顯著性正相關(guān)，故選擇將種姜粗、種姜重作為黃絲郁金種姜分級指標(biāo)。黃絲郁金種姜發(fā)芽率對種姜的產(chǎn)量有直接影響，含水量反映了種姜的生活力，凈度反映了種姜樣品的潔凈程度，故將發(fā)芽率、含水量和凈度也作為黃絲郁金種姜的分級指標(biāo)。因此，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)、操作簡便等因素綜合考慮，本標(biāo)準(zhǔn)未采納“種姜長”，并增加了“發(fā)芽率、含水量、凈度”3個(gè)指標(biāo)，更全面保障種姜質(zhì)量。此外，等外級的種姜粗小于8 mm、種姜重小于3 g，因其所含營養(yǎng)物質(zhì)少，故未納入黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)。通過各級種姜田間驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等外級種姜的藥材產(chǎn)量、質(zhì)量總體來看低于其他各級種姜，進(jìn)一步說明不將其納入黃絲郁金種姜分級標(biāo)準(zhǔn)是合理的。