李怡鵬， 石 林， 楊夢飛， 鄭寨生， 張尚法， 王凌云

(金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/浙江省特色水生蔬菜育種與栽培重點實驗室, 浙江 金華 321000)

蓮在生產(chǎn)用途上被分為三類，分別是藕蓮、子蓮和花蓮[1]。子蓮，以采收蓮子為主，花苞多，花瓣以單瓣為主，花色以紅色居多，偶有白色，蓮蓬大，結(jié)實率高，但地下莖細長，分枝多[2]。近幾年隨著市場的需求變化，子蓮品種又有加工干蓮與鮮蓮之分[3]。現(xiàn)階段最常見的有性雜交育種仍然是子蓮遺傳育種的主要技術(shù)之一，而選配雜交親本組合是進行雜交育種最先啟動也是最重要的環(huán)節(jié)[4-5]。親本組的選配首先考慮到的是其優(yōu)良的表型性狀，為了能讓兩者的優(yōu)良性狀更好地結(jié)合遺傳，必須考慮兩者之間的遺傳距離，確定其親緣關(guān)系[6]。傳統(tǒng)的育種方法主要是利用表型確定親本之間的親緣關(guān)系，由于子蓮的一些重要農(nóng)藝性狀遺傳能力相對來說會比較弱，或者極易受到環(huán)境等因素的影響，所以這種方法育種的效率不高[7]。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用RAPD、SRAP、AFLP、ISSR、基因組SSR等分子標(biāo)記進行蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系鑒定的研究越來越多。吳景棟等[8]在2011年采用14對RAPD有效引物對30份蓮種質(zhì)資源進行PCR擴增,結(jié)果表明花蓮與子蓮的相似遺傳系數(shù)較高。歐陽冬梅等[9]在2013 年開發(fā)了 11對SRAP引物對40份蓮材料進行擴增，擴增出多態(tài)性條帶 127 條,多態(tài)性頻率為69.0%，表明蓮屬具有豐富的遺傳多樣性。楊美等[10]在2011年利用AFLP分子標(biāo)記，對395份花蓮原始種質(zhì)進行了DNA多態(tài)性分析。劉藝平等[11]在2013年用篩選出的5條ISSR引物分別對6份野生半野生荷花品系和27份荷花栽培品種材料基因組DNA進行擴增,分析出野生半野生品系的各項參數(shù)值均低于栽培品種。分子標(biāo)記由于受環(huán)境因素影響小，且數(shù)量多，因而可以快速鑒別親本之間的親緣關(guān)系，在育種篩選親本的過程中節(jié)省大量的人力、物力和時間。

EST-SSR標(biāo)記除了具有多等位性、共顯性、高穩(wěn)定性等特點外，還可以在近緣種甚至遠緣種間通用，這不僅節(jié)約合成引物的成本，還使物種間比較譜圖的繪制和圖譜的整合更為便捷[12]。徐玉仙等[13]在2015年利用EST-SSR分子標(biāo)記對30個亞洲蓮、6個美洲蓮及14個亞美雜交蓮品種進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)亞洲蓮與美洲蓮雜交育成的后代品種與亞洲蓮品種的親緣關(guān)系比較接近。本研究采用EST-SSR技術(shù)，利用篩選的24對引物對浙江省金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院國家水生蔬菜育種創(chuàng)新基地保存的19份子蓮品種進行遺傳多樣性分析，了解其親緣關(guān)系，為子蓮的種質(zhì)資源保存及定向育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為金華市農(nóng)科院水生蔬菜種質(zhì)資源圃內(nèi)的19個子蓮品種(見表1)，栽培情況良好，管理水平相當(dāng)，葉片稀疏、長勢一致。

1.2 DNA提取

稱取子蓮新鮮幼嫩葉片80 mg，參照徐玉仙[13]的DNA提取試劑盒法，提取后-20 ℃下長期保存。

1.3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR擴增反應(yīng)體積為10.0 μL，其中包括2×ES Taqmix 5.0 μL；DNA模板1.0 μL；引物(濃度10 μmol/L)0.5 μL；ddH2O 3.5 μL。

PCR擴增反應(yīng)程序如下：

94 ℃預(yù)變性3 min，然后進入循環(huán)，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，溫度降到4 ℃即完成擴增并保存。

上述PCR產(chǎn)物首先經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠預(yù)檢測，然后向PCR產(chǎn)物中加入6 μL變性劑94 ℃變性5 min，立即放于冰上冷卻，冷卻后直接跑膠或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)聚丙烯酞胺電泳的結(jié)果，相同片段大小的條帶記為一個標(biāo)記等位基因，有帶為1，無帶為0，缺失為2。在19份子蓮材料中統(tǒng)計EST-SSR位點的等位基因變異，將統(tǒng)計的數(shù)據(jù)輸入電腦，根據(jù)以下公式計算每對引物的多態(tài)性信息含量(PIC)值：

式中，n表示等位基因總數(shù)，qi和qj分別為第i和第j個等位基因的頻率。

利用NTSYS-pc Version 2.10軟件計算所有材料間的遺傳相似性系數(shù)，基于這些遺傳相似性系數(shù)用非加權(quán)平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means,UPGMA)構(gòu)建聚類樹系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。DNA主帶清晰、完整，彌散較少，符合SSR對DNA的要求。

圖1 部分DNA的電泳檢測結(jié)果

核酸測定儀檢測稀釋50倍的DNA樣品，讀取DNA濃度值(表2)。A260/A280值多數(shù)大于1.8，在2.0左右，DNA純度較高，符合SSR分析的需要。

表2 稀釋50倍DNA濃度

2.2 EST-SSR多態(tài)性分析

從80對多態(tài)性EST-SSR引物中進一步獲得24對穩(wěn)定擴增、高多態(tài)性的引物對19份子蓮品種進行遺傳多樣性分析(見圖2)。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對24對EST-SSR引物進行擴增篩選。結(jié)果顯示，24對引物擴增結(jié)果清晰明亮，多態(tài)性條帶豐富，適合對19個子蓮品種進行EST-SSR-PCR擴增。多態(tài)性信息量(PIC)可用來評估每對引物標(biāo)記的多態(tài)性信息量水平(高：PIC>0.5；適中：0.5>PIC>0.25；低：PIC<0.25)[14]。在本試驗篩選的24對EST-SSR引物中，所得PIC值最低的為0.58(NNFB_83)，最高的為0.91(NNFB_1491)，平均每對引物的PIC值為0.77，表明本試驗所篩選的24對EST-SSR引物具有較高的多態(tài)性，可以對子蓮種質(zhì)資源進行有效的遺傳多樣性分析。引物信息見表3。

表3 用于遺傳性分析的24對EST-SSR引物信息

圖2 部分子蓮品種的擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 基于EST-SSR的遺傳多樣性分析

根據(jù)24對EST-SSR引物的擴增結(jié)果，用NTSYS 2.11軟件，依據(jù)相似系數(shù)和非加權(quán)組平均法(UPGMA)進行聚類分析，得出19份子蓮種質(zhì)資源的聚類圖(圖3)。從圖3可看出，19份試驗的子蓮品種的遺傳相似系數(shù)(GS)范圍為0.42～0.94。根據(jù)遺傳相似系數(shù)越小遺傳距離越大，其兩者之間的親緣關(guān)系就越疏遠的理論基礎(chǔ)?？梢钥闯霰驹囼炈峁┑?9個子蓮品種之間差異明顯，具有較豐富的遺傳多樣性。依據(jù)圖3，發(fā)現(xiàn)在相似系數(shù)為0.55處時，所供試材料被分為4組，第Ⅰ組有7個，分別是建選6號、處州白蓮、紅花建蓮、建選10號、建選30號、建選2號和建選17號。第Ⅱ組只有建選35號一個品種。第Ⅲ組有4個，分別是太空5號、滿天星、太空3號、京廣1號。第Ⅳ組則分別是金芙蓉1號、星空牡丹、宣蓮、太空36號、XS-4、初平芙蓉和湘蓮。

圖3 子蓮種質(zhì)資源的聚類樹圖

3 討 論

本實驗把供試的子蓮分為4組，其中紅花建蓮和4個建選系的品種都分在了第Ⅰ組里，紅花建蓮作為建寧的地方品種很可能是建選系列的親本材料，這與建選系列的選育過程相吻合[15]，同時發(fā)現(xiàn)處州白蓮與紅花建蓮的相似系數(shù)為0.99，且他們的農(nóng)藝學(xué)性狀也沒有太大的差別，分布地域也相鄰。因此，推測這兩個品種很有可能是同一個品種，由于地域的不同被分別命名，成為地方品種。還有一種可能就是因為兩地相鄰，資源圃在引種時發(fā)生串種，引到的都是同一個品種。第Ⅱ組只有建選35號一個品種，它與其他子蓮品種的遺傳距離都比較大，相對靠近紅花建蓮，這與建選35號是紅花建蓮和太空蓮20號的雜交后代相符合[16]。第Ⅲ組有4個，分別是太空5號、滿天星、太空3號、京廣1號。太空3號和太空5號都是由謝克強等[17]選育出的新品種，而京廣1號是由太空3號采用離子注入法選育出來的子蓮品種，其親緣關(guān)系符合現(xiàn)有結(jié)論[18]。第Ⅳ組則分別是金芙蓉1號、星空牡丹、宣蓮、太空36號、XS-4、初平芙蓉和湘蓮，金芙蓉是以星空牡丹為親本選育出來的，其兩者在一個亞群里。太空36號與湘蓮的遺傳距離比較近，而太空36號是通過子蓮衛(wèi)星搭載、太空誘變選育而來，所以其可能是湘蓮太空誘變的后代。

大多數(shù)分子標(biāo)記方法可以有效地把蓮種質(zhì)資源分為藕蓮、子蓮和花蓮三大類，但在細分遺傳距離較近的種質(zhì)資源時，不同方法會有差異。例如本實驗結(jié)果在太空36號和星空牡丹的分類上與歐陽冬梅等[9]利用SRAP構(gòu)建蓮指紋圖譜的結(jié)論一致，但在建選17號的分類上，SRAP表明其與紅花建蓮相距較遠，而EST-SSR揭示其與紅花建蓮相近，兩者有較大差異，同時在京廣1號的分類上也存在差異。本實驗結(jié)果與汪雪芹[19]利用SSR做的子蓮遺傳多樣性的分析結(jié)果相近。說明利用EST-SSR標(biāo)記技術(shù)對遺傳距離較近的種質(zhì)資源遺傳多樣性分析是可行的[20]，子蓮基本上都是異花授粉，不同品種之間的基因很容易通過蟲媒進行交流，造成了品種間遺傳資源的混合和品種內(nèi)遺傳較大的差異，即使同一區(qū)域內(nèi)的不同品種也會有較大的差異[21]。通過EST-SSR分子標(biāo)記可以有效解決子蓮種質(zhì)資源混亂、遺傳背景不清晰和親緣關(guān)系等問題，為今后子蓮的種質(zhì)資源保存及定向育種提供理論基礎(chǔ)。