程 露， 職銘陽， 吳 迪， 陸勁羽， 項 陽， 鄭曉明， 逄洪波

(1.沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 遼寧 沈陽 110034；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所， 北京 100081)

水稻是人類生活中必不可少的糧食作物之一，世界上超過50%的人口以水稻為食[1]。全球種植水稻的國家大多數(shù)都遭遇過嚴(yán)重的冷害問題[2-4]。我國平均每五年就有一次大規(guī)模的低溫，因冷害問題導(dǎo)致我國水稻年產(chǎn)量減少30億～50億kg[5]。近年來，由于全球變暖和溫室效應(yīng)的不斷累積，導(dǎo)致極端惡劣天氣出現(xiàn)的次數(shù)和規(guī)模不斷增大，因低溫造成的糧食減產(chǎn)問題愈加嚴(yán)重，給我國的糧食安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國計民生帶來許多不利影響。

有關(guān)水稻低溫冷害的研究已有不少報道，低溫脅迫會不可逆轉(zhuǎn)地破壞水稻的整個生理和代謝過程，不僅對水稻的外部形態(tài)(如發(fā)育速度緩慢；株高、葉面積、群體生產(chǎn)力下降；生殖器官受損、空秕率增多等)造成嚴(yán)重的影響[6-7]，同時也會引起一系列生理生化指標(biāo)(如葉綠素含量下降；丙二醛含量增高；相對電導(dǎo)率、可溶性糖以及其他代謝物含量增高等)的變化[8-11]。

光合作用是評價植物生長質(zhì)量的重要依據(jù)，葉綠素含量對作物的產(chǎn)量有著巨大的影響[12]，作物產(chǎn)量大約 95% 是由葉綠素含量決定的。葉綠體的結(jié)構(gòu)受到冷害脅迫時極易被破壞，葉綠體蛋白變性、葉綠素合成量減少、葉片顏色褪綠、植株黃化、同時光合同化能力下降，植株生長遲緩，產(chǎn)量與質(zhì)量下降[13]。光系統(tǒng)是植物低溫脅迫下首先受到傷害的組織，其中光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)在植物光合作用的光反應(yīng)過程中發(fā)揮著巨大的作用，影響光合作用中電子傳遞和光能轉(zhuǎn)化效率[14-15]。低溫條件下，PSⅡ結(jié)構(gòu)受損，光化學(xué)活性受抑制，光能轉(zhuǎn)化效率降低。葉綠素?zé)晒鈪⑴c光合作用中的各個過程，當(dāng)光合作用中某一點發(fā)生變化時，葉綠素?zé)晒鈩t會發(fā)生改變，因此可以將葉綠素?zé)晒庾鳛樘骄恐参锕夂献饔玫奶结?，并將葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的大小視為植物耐受逆境的生理指標(biāo)[16]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)主要包括：暗適應(yīng)初始熒光F0、暗適應(yīng)最大熒光Fm、暗適應(yīng)最大可變熒光Fv、最大光化學(xué)效率Fv/Fm、PSⅡ潛在活性Fv/F0等。

培育耐寒品種是解決冷害問題最直接的手段。王晨光等[17]以黑龍江省監(jiān)獄局水稻所提供的3個水稻品種為材料，分析其葉綠素含量、根系活力等4個生理指標(biāo)的變化，鑒定出1個耐寒性較強(qiáng)的品種；王蘭等[18]以葉綠素含量為評價指標(biāo)，從84份水稻品種中初步篩選出13份苗期耐寒材料；周新橋等[7]以植株的外部形態(tài)和死亡率作為評價指標(biāo)，從南方稻區(qū)初步篩選出的18份水稻品種中鑒定出6份耐寒性較強(qiáng)的材料；丁國華等[19]利用自然低溫脅迫鑒定了130份耐寒性較好的材料。

本研究以30個水稻品種作為研究對象，測定低溫脅迫前后及一段恢復(fù)期內(nèi)的葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的變化，進(jìn)而對水稻種質(zhì)資源的苗期耐寒性進(jìn)行篩選和鑒定，以期為水稻抗寒品種選育及耐寒分子育種提供中間材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的30個水稻品種均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，具體品種信息詳見表1。

表1 用于本實驗水稻品種詳細(xì)信息

1.2 材料的處理

種子放于 50 ℃ 培養(yǎng)箱處理 72 h 打破休眠后，營養(yǎng)土中播種，置于培養(yǎng)室(30 ℃，光照12 h/黑暗12 h)生長至14 d三葉一心期后，放入人工氣候培養(yǎng)箱(15 ℃，光照12 h/黑暗12 h)48 h后，放回培養(yǎng)室恢復(fù)生長。

1.3 生理指標(biāo)的測定

實驗共選取處理前(T1)、15 ℃ 脅迫2 d(T2)、培養(yǎng)室恢復(fù)生長1 d(T3)、恢復(fù)生長3 d(T4)和恢復(fù)生長5 d(T5)這5個時間點進(jìn)行葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的測定，每個指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.3.1葉綠素含量的測定

采用 SPAD-502 Plus 葉綠素儀(浙江托普儀器公司)進(jìn)行測定。

1.3.2光合指標(biāo)的測定

采用pocket PEA 便攜式熒光儀(英國Hansatech公司)進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013軟件計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。利用基迪奧平臺(http://www.omicshare.com/tools)，采用STEM軟件的原理，繪制箱線圖及趨勢分析圖。直接采用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值(T1～T1，T2～T1，T3～T1…)做趨勢分析，顯著性設(shè)置為默認(rèn)值(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水稻品種在低溫脅迫下葉綠素含量的變化

為了觀察不同水稻品種在低溫脅迫條件下葉綠素含量的變化，試驗對5個時間點的葉綠素含量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示，低溫脅迫前，粳稻葉綠素含量普遍高于秈稻；粳稻在受低溫脅迫時，葉片葉綠素含量雖然出現(xiàn)小幅下降，但在恢復(fù)生長后出現(xiàn)回升，走勢相對平穩(wěn)，說明粳稻在受低溫脅迫時恢復(fù)力較好；而秈稻在受低溫脅迫時，葉綠素含量呈明顯的下降趨勢。整體上，秈稻的葉綠素含量變化受低溫影響較大，說明粳稻的耐寒能力強(qiáng)于秈稻。

圖1 低溫處理前后粳稻與秈稻葉綠素含量箱線圖

為了進(jìn)一步觀察粳稻各個品種間的差異，試驗對16個粳稻品種5個時間點的葉綠素含量變化進(jìn)行了趨勢分析(圖2)。從圖2可以看出，粳稻葉綠素含量變化的趨勢分為3種。A趨勢4個品種(z 973、z 1076、z 1114和z 1094)的葉綠素含量在低溫脅迫前后5個時間點內(nèi)一直呈現(xiàn)下降趨勢，下降值高達(dá)4，相較于未處理前存在顯著差異(p<0.05)，說明這4個粳稻品種耐寒性較差。B趨勢的6個品種(z 947、z 955、z 969、z 1034、z 1083和z 1107)在低溫脅迫2 d及恢復(fù)生長1 d內(nèi)，葉綠素含量下降幅度較小，相較于未處理前不存在顯著差異；恢復(fù)生長3 d后，不同品種葉綠素含量回升的幅度不一樣，說明各品種耐寒性存在差異；恢復(fù)生長5 d 后，B趨勢的6個品種的葉綠素含量恢復(fù)到未處理前水平。C趨勢包含6個品種，分別為z 931、z 976、z 984、z 1001、z 1049 和z 1080，其在低溫脅迫2 d內(nèi)，葉綠素含量下降較?。换謴?fù)生長1 d內(nèi)葉綠素含量無明顯變化；恢復(fù)生長3 d內(nèi)，葉綠素含量出現(xiàn)不同程度的回升；恢復(fù)生長5 d后，葉綠素含量出現(xiàn)小范圍下降。從葉綠素含量變化趨勢可以初步篩選出粳稻中除了A趨勢4個品種外，其余品種的耐寒性相對較好。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細(xì)線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

與粳稻相比，14個秈稻品種在低溫脅迫前后5個時間點其葉綠素含量變化趨勢相對比較簡單，只有兩個趨勢(圖3)。A趨勢包含了13個品種，分別為z 930、z 939、z 940、z 945、z 953、z 992、z 1020、z 1048、z 1054、z 1056、z 1057、z 1075和z 1118，其葉綠素含量在低溫處理前后5個時間點一直在大幅下降，且相較于未處理前存在顯著差異，說明絕大部分秈稻品種對低溫敏感，耐寒性較差。B趨勢僅包含z 1082一個品種，其葉綠素含量在低溫脅迫2 d內(nèi)，下降幅度較少；并且在恢復(fù)生長3 d內(nèi)，葉綠素含量出現(xiàn)回升；恢復(fù)生長5 d后，雖然葉綠素含量出現(xiàn)小幅下降，但較未處理前下降較小，說明該秈稻品種較絕大多數(shù)秈稻而言，為較好的耐寒品種?？傮w上看，葉綠素含量變化范圍較大，呈明顯的下降趨勢；但個別品種(B趨勢品種)的葉綠素含量較未處理前差異較小，為較好的耐寒品種。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細(xì)線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

2.2 低溫處理對不同水稻品種Fv/Fm 值的影響

圖4是30個水稻品種的PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)結(jié)果，從圖4可以看出，不同水稻品種其幼苗葉片間的Fv/Fm值在未受到低溫傷害前不存在顯著差異，均在0.80～0.82之間。15 ℃放置2 d后，粳稻與秈稻品種Fv/Fm值均出現(xiàn)降低現(xiàn)象，每個品種下降的程度各不相同，總體上看秈稻下降幅度更大?；謴?fù)生長后，粳稻與秈稻的Fv/Fm值均表現(xiàn)出不同幅度的上升現(xiàn)象，且粳稻恢復(fù)水平更快。由于各水稻品種在低溫處理前后其Fv/Fm值保持在0.75～0.83之間，相差很小，無法很好地反映出其顯著變化趨勢，故不做分析。

圖4 低溫處理前后粳稻與秈稻Fv/Fm值箱線圖

2.3 低溫處理對不同水稻品種Fv/F0值的影響

圖5是30個水稻品種的Fv/F0值在低溫脅迫前后5個時間點的測定結(jié)果。未受到低溫傷害前，各品種的Fv/F0值均保持在0.40～0.45之間，無顯著差異。低溫處理2 d后，粳稻與秈稻的Fv/F0值均出現(xiàn)下降現(xiàn)象，總體上秈稻下降幅度較大?；謴?fù)生長一段時間后，粳稻與秈稻的Fv/F0值均表現(xiàn)出不同程度的回升現(xiàn)象，且粳稻回升更快，說明粳稻恢復(fù)力更強(qiáng)。

圖5 低溫處理前后粳稻與秈稻Fv/F0值箱線圖

為了進(jìn)一步觀察粳稻各個品種間的差異，對16個粳稻品種5個時間點的Fv/F0值進(jìn)行了趨勢分析，變化趨勢大致分為4種(見圖6)。A趨勢僅包含z 1094一個品種，其Fv/F0值在低溫脅迫后一直呈現(xiàn)下降趨勢，且恢復(fù)5 d后其Fv/F0值相較于處理前存在顯著差異，說明該粳稻品種受溫度影響較大，耐寒性較差，為冷敏感型品種。B趨勢2個品種(z 969和z 984)在低溫脅迫至恢復(fù)1 d內(nèi)，F(xiàn)v/F0值出現(xiàn)小范圍的下降后；恢復(fù)生長1 d后，出現(xiàn)不同程度的回升現(xiàn)象，特別是最初下降幅度大的品種，其漲幅迅速，說明受傷害后恢復(fù)較好?；謴?fù)生長5 d后，基本恢復(fù)到進(jìn)行低溫脅迫前的水平，說明植株已經(jīng)恢復(fù)正常生長。C趨勢2個品種(z 1034和z 1107)的Fv/F0值，在低溫處理2 d后下降范圍較小，與處理前不存在顯著差異?；謴?fù)生長1 d后，出現(xiàn)不同程度短暫上升的現(xiàn)象?；謴?fù)生長3 d后，其Fv/Fm值均再次出現(xiàn)下降趨勢，范圍較小?；謴?fù)生長5 d后，其Fv/Fm值較未處理前差異不顯著。D趨勢包含11個品種，分別為z 931、z 947、z 955、z 973、z 976、z 1001、z 1049、z 1076、z 1080、z 1083和z 1114，呈W狀走勢，即在低溫處理2 d內(nèi)，其Fv/Fm值下降范圍較小，且在恢復(fù)生長1 d內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的短暫回升現(xiàn)象；雖然恢復(fù)生長3 d內(nèi)均再次出現(xiàn)短暫小幅下降，但恢復(fù)生長5 d后其比值與未處理前無明顯差異，甚至個別品種其比值高于對照。通過低溫前后各品種Fv/F0值變化的趨勢圖，初步得出粳稻中除了A趨勢1個品種外，其余品種耐寒性較好。且Fv/Fm值的變化趨勢與葉綠素含量的變化基本一致。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細(xì)線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

進(jìn)一步對14個秈稻品種在低溫脅迫前后5個時間點的Fv/F0值變化進(jìn)行趨勢分析(圖7)。A趨勢僅有z 1020 一個品種的Fv/F0值在低溫處理前后5個時間點內(nèi)一直大幅下降，極值達(dá)到4，說明該秈稻品種極易受溫度的影響，為極不耐寒品種。B趨勢含有1個品種(z 1082)，盡管在低溫脅迫至恢復(fù)1 d內(nèi)，F(xiàn)v/F0值顯著下降，但在恢復(fù)生長1 d后迅速上升，且恢復(fù)生長5 d后其Fv/F0值恢復(fù)至對照水平，說明該品種低溫脅迫后恢復(fù)速度快，相較于絕大多數(shù)秈稻而言，為較好的耐寒品種。C趨勢z 940在低溫脅迫2 d內(nèi)，F(xiàn)v/F0值大幅下降，雖然恢復(fù)生長1 d后，出現(xiàn)短暫回升現(xiàn)象，但在恢復(fù)生長5 d后，其Fv/F0值相較于未處理前仍存在顯著差異，為不耐寒品種。D趨勢的11個品種(z 930、z 939、z 945、z 953、z 992、z 1048、z 1054、z 1056、z 1057、z 1075和z 1118)整體呈W走勢，即低溫處理2 d內(nèi)，F(xiàn)v/F0值下降程度較大，最大下降1.5；恢復(fù)生長1 d內(nèi)，F(xiàn)v/F0值均出現(xiàn)短暫上升現(xiàn)象，上升的幅度各不相同；恢復(fù)生長3 d內(nèi)，再次出現(xiàn)短暫下降，恢復(fù)生長5 d后，絕大多數(shù)品種的Fv/F0值仍低于冷處理前，說明恢復(fù)速度慢，耐寒性較差。通過低溫前后各品種Fv/F0值變化的趨勢圖，可以得出秈稻中除了B趨勢1個品種外，其余品種耐寒性較差。

注：紅色實線表示模擬差值所做的模擬趨勢圖，灰色細(xì)線表示不同水稻品種的實際趨勢圖。

3 討 論

目前，有關(guān)水稻苗期耐寒性篩選鑒定的研究主要根據(jù)外部形態(tài)特征以及生理生化指標(biāo)兩方面開展[7]。光合作用是植物維持機(jī)體正常生命活動的必要生物過程，通過植物光合作用強(qiáng)弱可以判斷其生長的好壞。葉綠素在光吸收中發(fā)揮著巨大的作用，葉綠素的含量直接影響了植株的光合效率和產(chǎn)量[12]。在一定范圍內(nèi)，植物體葉綠素含量越高，生物學(xué)產(chǎn)量越高[18]。當(dāng)植物受到冷害脅迫時，葉綠體結(jié)構(gòu)受破壞，葉綠素合成降低，光合作用受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)活動受抑制，可能是光合作用的降低引起PSⅡ的潛在活性Fv/F0的下降，抑制了原初光能反應(yīng)過程，使得PSⅡ無法正常傳遞電子，導(dǎo)致最大光化學(xué)效率Fv/Fm的下降。王國莉等[20]以光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)為評價指標(biāo)，比較低溫對水稻耐冷品種和冷敏感品種二者之間的影響。本研究以葉綠素含量以及熒光參數(shù)Fv/Fm值和Fv/F0值作為水稻苗期耐寒性的鑒定評價指標(biāo)，研究結(jié)果表明，不同品種的水稻幼苗在低溫脅迫條件下，其葉綠素含量、Fv/Fm值和Fv/F0值下降程度呈現(xiàn)出明顯的差別，葉綠素含量、Fv/Fm值和Fv/F0值的下降程度均與水稻品種的耐寒性呈明顯的反比關(guān)系；隨著溫度恢復(fù)升高，三者均出現(xiàn)不同程度的回升現(xiàn)象。因此，葉綠素含量以及熒光參數(shù)Fv/Fm值和Fv/F0值可以作為低溫脅迫條件鑒定水稻苗期耐寒性的生理指標(biāo)。

以往的研究結(jié)果表明，栽培稻的兩個亞種在漫長的人工馴化和進(jìn)化過程中逐漸適應(yīng)各自的生存環(huán)境，粳稻生長在溫帶及低緯度地區(qū)，秈稻生長在熱帶及亞熱帶地區(qū)，故粳稻的耐寒性普遍強(qiáng)于秈稻[21-22]。本研究測定了30個水稻品種低溫前后的葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的變化，結(jié)果顯示粳稻的耐寒性普遍強(qiáng)于秈稻，與前人的結(jié)果相一致。同時發(fā)現(xiàn)粳稻個別品種，如z 973、z 1076、z 1094和z 1114在受低溫脅迫時，葉綠素含量下降量較大，甚至在恢復(fù)生長后葉綠素含量較未處理前仍存在較大差異，說明粳稻中也存在低溫敏感品種。而秈稻品種如z 1082在受到冷害時，葉綠素含量下降程度較小，能夠正常合成葉綠素，屬于較好的耐寒品種。南方水稻種植區(qū)為了提高種植產(chǎn)量，經(jīng)常會選擇一些苗期耐寒性強(qiáng)的早秈稻，故水稻品種的耐寒性不僅由遺傳背景決定，還與其地理分布及當(dāng)?shù)氐姆N植策略相關(guān)。本研究根據(jù)低溫脅迫下葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值的變化，初步篩選出苗期耐寒性較強(qiáng)的水稻種質(zhì)資源13份，分別為黑龍江省的z 976、z 984、z 1034、z 1080和z 1001，遼寧省的z 969和z 1107，吉林省的z 931和z 944，云南省的z 1083，北京市的z 947，廣東省的z 1082及日本的z 1049。

綜上所述，本研究通過生理指標(biāo)對30個水稻品種的苗期耐寒性進(jìn)行鑒定評價。結(jié)果表明，低溫影響水稻生長發(fā)育中葉綠素的合成，且對不同水稻品種的影響程度不一，總體上粳稻耐寒性好于秈稻。本研究以葉綠素含量、Fv/Fm值及Fv/F0值可以很好的區(qū)分各個品種的苗期耐寒性，并初步篩選出苗期耐寒性較強(qiáng)的水稻種質(zhì)資源13份，研究結(jié)果對耐寒水稻種質(zhì)的選育及耐寒后續(xù)基因挖掘及功能驗證具有一定的參考意義。