任延靖， 邵登魁

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室， 西寧 810016；2.青海大學(xué)，三江源生態(tài)和高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室， 西寧 810016)

蕪菁(Brassicarapassp.rapaL. 2 n=2 x=20)，又稱為蔓菁、盤菜等，是我國及東亞廣泛種植的一種重要的十字花科葉用和根用蔬菜，也是我國最早人工種植的蔬菜之一，同時也作為重要的藥用和飼料用作物，能夠廣泛生長于海拔3 500 m以上的高原地區(qū)[1]，其富含芥子油苷[2-4]、膳食酚類[4]、膳食纖維、維生素C以及生物活性物質(zhì)[5]，是一類營養(yǎng)豐富且全面的作物，其研究方向主要集中在抗缺氧等相關(guān)的藥用價值、以花青素為代表的色素調(diào)控、重金屬富集以及單倍體再生體系的構(gòu)建等。

在蕪菁的藥用價值方面，Tang等[6]比較了蕪菁的功能活性物質(zhì)以及抗疲勞的作用，結(jié)果表明，在小鼠負(fù)重游泳模型中，蕪菁多糖具有良好的抗疲勞作用；Chu等[7]在人體試食實驗結(jié)合低氧耐受測試中，進一步驗證了西藏蕪菁提高健康人群低氧耐受的功效，同時篩選出其抗氧化活性優(yōu)良的化合物：反式/順式-對香豆酸葡萄糖苷，發(fā)現(xiàn)該化合物能夠增強物理缺氧條件下的細(xì)胞的活力并減少細(xì)胞凋亡；Li等[8]進一步研究了對香豆酸葡萄糖苷在預(yù)防缺氧性肺水腫和缺氧性腦水腫的功效，證實了其在預(yù)防缺氧性肺水腫和缺氧性腦水腫中的重要作用并闡明其調(diào)控機制；王文寧[9]分析了蕪菁營養(yǎng)成分及其對改善小鼠腸道菌群的作用，發(fā)現(xiàn)蕪菁可以促進小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌的增殖，抑制腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，這些研究結(jié)果顯示蕪菁資源具有良好的應(yīng)用前景，但是目前對于蕪菁基因組的探究還鮮見報道。

基因組包括細(xì)胞核基因組和細(xì)胞質(zhì)基因組，細(xì)胞質(zhì)基因組又包含葉綠體、線粒體等小細(xì)胞器中分離出的DNA，被子植物完整的葉綠體基因組通常包含4個部分：一個大的單拷貝區(qū)域(LSC)、一個小的單拷貝區(qū)域(SSC)和兩個位于LSC和SSC之間的倒置重復(fù)區(qū)(IR)、IRa和IRb，最終形成一個典型的四方圓環(huán)[10]，與核基因組相比，從母本遺傳的葉綠體基因組在基因含量和基因組結(jié)構(gòu)上高度保守，通常葉綠體基因組的長度在120～160 kb之間，特異基因的數(shù)量在110～130個之間[11]。在光合作用中，葉綠體基因組基因在淀粉、氨基酸、脂肪酸和色素的生物合成中起著至關(guān)重要的作用[12]。近年來，高通量技術(shù)的快速發(fā)展，解析了越來越多的植物的葉綠體基因組[11,13]。

本研究中，針對蕪菁葉綠體基因組進行了組裝，結(jié)果顯示蕪菁葉綠體呈環(huán)狀雙鏈，共有132個基因，進一步分析了蕪菁葉綠體的結(jié)構(gòu)特征及親緣關(guān)系，本研究結(jié)果為分析蕪菁細(xì)胞質(zhì)基因組、了解蕪菁親緣關(guān)系奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用蕪菁材料W 21于2020年3月播種于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院試驗溫室中，待生長至65 d時，收集新鮮健康的葉片，用蒸餾水沖洗干凈，然后迅速在液氮中冷凍，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取及葉綠體基因組測序

采用改良CTAB法[14]提取基因組DNA，DNA質(zhì)檢合格后，用機械打斷的方法(超聲波)將DNA片段化，然后對片段化的DNA進行純化、末端修復(fù)、3′端加A以及連接測序接頭[13]，再用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行PCR擴增形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Hi Seq 2500進行測序。

1.3 葉綠體基因組組裝與注釋

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)過濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量的片段，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，將高質(zhì)量的數(shù)據(jù)進行序列組裝，利用MITObim軟件[15]參考十字花科蕓薹屬芥菜的葉綠體基因組(NC_030450,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_030450.1)的保守序列對蕪菁的葉綠體基因組進行組裝，得到局部的組裝結(jié)果，以局部的組裝序列進行延伸，最終獲取完整的蕪菁葉綠體基因組。得到的葉綠體組基因用DOGMA[16]和Mitofy[17]進行基因注釋，注釋結(jié)果通過CpGAVAS pipeline[18]進行驗證，最終利用在線軟件GDRAW(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)[19]進行作圖。完整的葉綠體基因組序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號MT 409177。

1.4 重復(fù)序列分析

利用PHOBOS軟件v 3.3.12[20]搜索蕪菁葉綠體單核苷酸重復(fù)以上的Simple sequence repeat(SSR)位點，設(shè)置參數(shù)為：單核苷酸重復(fù)≥6，二核苷酸重復(fù)≥5，三核苷酸重復(fù)≥4，四核苷酸重復(fù)≥3，五核苷酸及六核苷酸重復(fù)≥1，所有的搜索結(jié)果最終通過人工驗證[21]。

1.5 親緣關(guān)系分析

為了鑒定蕪菁與其他十字花科蔬菜的親緣關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載白菜(Brassicarapasubsp.pekinensis，NC_015139；Brassicarapa(field mustard，NC_040849)；甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.italicacultivar Maratython，MH 388765；Brassicaoleraceavar.italicacultivar Green Sprout，MH 388764；Brassicaoleraceavar.italicacultivar 2001 B，MN 649876)以及擬南芥(Arabidopsisthalianathale cress，NC_000932)的葉綠體基因組，采用MEGA軟件對上述葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合Du等[11]對82份十字花科作物的進化關(guān)系分析，鑒定蕪菁與其他十字花科蔬菜之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕪菁葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

通過Illumina Hi Seq 2500測序平臺，共獲得8.38 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，其中Q 30為91.65%(表1)，通過組裝及可視化作圖，發(fā)現(xiàn)蕪菁葉綠體基因組呈雙鏈環(huán)狀，與姜黃[22]、紫薇[23]、木蘭花[24]等高等植物相似，包含典型的4個部分：83 512 bp的大單拷貝區(qū)域(LSC)、17 683 bp的小單拷貝區(qū)域(SSC)及26 213 bp的兩個反向重復(fù)序列(IRa和IRb)(圖1，表2)，組成一個序列全長為153 621 bp的完整的蕪菁葉綠體基因組。

注：內(nèi)側(cè)基因順時針轉(zhuǎn)錄，外側(cè)基因逆時針轉(zhuǎn)錄，深灰色區(qū)域表示圈內(nèi)對應(yīng)的GC含量，淺色區(qū)域表示相對應(yīng)的AT含量。

表1 蕪菁基因組測序的數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計

在蕪菁葉綠體基因組中，共檢測到132個基因，包括87個編碼蛋白質(zhì)的基因、37個轉(zhuǎn)運RNA基因和8個核糖體RNA基因，在這132個基因中，有15個基因在IR區(qū)域呈現(xiàn)雙拷貝，分別是ndhB、rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23、rps7、rps12、rpl2、rpl23、trnI-CAU、trnV-GAC、trnN-GUU、ycf1、ycf2和ycf15(表2和表3)。

表2 蕪菁葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

表3 蕪菁葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

對蕪菁葉綠體基因組的堿基組成進行分析，發(fā)現(xiàn)CG含量占總堿基數(shù)的36.3%，G和C的含量分別為18.6%和17.8%，其中IR區(qū)域中的GC含量(43.2%)高于LSC區(qū)域(34.1%)和SSC區(qū)域(29.3%)，相反，總的AT含量在SSC區(qū)域(71.9%)高于IR區(qū)域(57.7%)，A和T的含量分別為31.4%和32.3%，該結(jié)果與其他十字花科蔬菜，如蘿卜[25]、豆瓣菜[26]以及野白菜[11]等的葉綠體基因組GC含量相似(表4)。

表4 蕪菁葉綠體基因組的堿基組成

2.2 重復(fù)序列分析

重復(fù)序列又稱為簡單序列重復(fù)(SSR)或微衛(wèi)星序列，廣泛存在于基因組中，通常包含隨機的1～6個核苷酸[25-28]，一般用于分析群體遺傳學(xué)[29-30]、進化關(guān)系[31]以及物種鑒別等。通過對蕪菁葉綠體基因組的SSR分析，共發(fā)現(xiàn)13種類型的SSR，包括2種單核苷酸、2種二核苷酸、3種三核苷酸和6種四核苷酸類型重復(fù)(表5)，A/T單核苷酸重復(fù)是最多的一類，占總SSR的96.90%，AT/TA二核苷酸重復(fù)占總SSR的2.02%，A/T單核苷酸重復(fù)在其他物種中也較為多見[11,32]，說明短的A/T重復(fù)是葉綠體基因組的普遍特征[33]，在蕪菁葉綠體基因組中沒有發(fā)現(xiàn)五核苷酸和六核苷酸重復(fù)的SSR，但在野白菜葉綠體基因組中檢測到兩個六核苷酸重復(fù)的SSR，這些結(jié)果表明，SSR參與了不同物種葉綠體基因組遺傳多樣性的鑒定。

表5 蕪菁葉綠體基因組中SSR類型及數(shù)量

2.3 進化關(guān)系分析

利用MEGA軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的6個十字花科作物的與蕪菁共同構(gòu)建葉綠體基因組系統(tǒng)進化樹，進化樹顯示將7類作物分為兩大類，一類是擬南芥，另一類是不同白菜類變種和甘藍(lán)類變種，其中蕪菁與白菜類聚為一類，親緣關(guān)系與白菜較近，與甘藍(lán)類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

注：所有的葉綠體基因組均下載于NCBI，登錄號如下：白菜，NC_015139；野白菜，NC_040849；甘藍(lán)，MH 388765；MH 388764；MN 649876；擬南芥NC_000932.

2.4 蕪菁與白菜葉綠體基因組比對

根據(jù)進化樹的結(jié)果，比較蕪菁和白菜的葉綠體基因組特征，發(fā)現(xiàn)兩個基因組在4個區(qū)域處的連接序列(圖3)，結(jié)果表明連接處共有4個基因(rps19,ycf1,ndhF和trnH)，其中rps19和trnH的長度相同，但是基因所在的位置略有差異，ycf1的兩個拷貝在蕪菁和白菜之間均有差異，位于IRb區(qū)域和SSC區(qū)域連接處的ycf1在蕪菁和白菜中分別為1 029 bp和1 032 bp，蕪菁中3 bp的缺失發(fā)生在IRb區(qū)域，位于IRa區(qū)域和SSC區(qū)域的ycf1在蕪菁和白菜中分別為5 310 bp和5 313 bp。trnH基因在蕪菁和白菜中分別位于LSC區(qū)域距離IRa區(qū)域2 bp和3 bp遠(yuǎn)的位置，Du等[11]分析了8個十字花科物種的區(qū)域連接處，也發(fā)現(xiàn)了4個基因，rps19,ycf1,ndhF和trnH，其中rps19基因在8個物種的長度相同，均為279 bp，說明rps19基因在十字花科物種中高度保守，ycf1和ndhF基因在長度和位置上均不同，說明ycf1和ndhF基因比較容易突變，本研究結(jié)果與這些結(jié)果類似，這些區(qū)域鏈接處序列的分析結(jié)果說明構(gòu)建的蕪菁葉綠體基因組是可靠的。

圖3 蕪菁和白菜葉綠體基因組的比對

3 結(jié) 論

本研究首次對蕪菁葉綠體及基因組的序列結(jié)構(gòu)進行了詳細(xì)分析，構(gòu)建了蕪菁葉綠體基因組信息，同時分析序列的堿基組成、SSR以及區(qū)域連接處的基因，同時構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進化樹，為進一步深入了解細(xì)胞質(zhì)基因組及蕪菁研究奠定了良好的基礎(chǔ)。