田文杰， 喬 光， 文曉鵬， 田 田， 洪 怡

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴陽(yáng) 550025)

櫻桃(CerasuspseudocerasusLindl.)是薔薇科、李屬、櫻亞屬植物，成熟期早，營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)、社會(huì)價(jià)值高[1]。櫻桃是貴州省精品水果產(chǎn)業(yè)之一，在貴州省西北部、中部和北部廣泛種植，根據(jù)貴州省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳統(tǒng)計(jì)，在“十三五”期間，貴州省櫻桃種植面積達(dá)3.33萬(wàn)hm2，主要以瑪瑙紅、黑珍珠等中國(guó)櫻桃為主，在全省脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興上發(fā)揮了重要作用。

植原體(phytoplasma)又稱(chēng)為類(lèi)菌原體(mycoplasma-likeorganism，MLO)，是一種由細(xì)胞膜包裹、沒(méi)有細(xì)胞壁、不能夠人工培養(yǎng)、寄存于植物韌皮部及刺吸式介體昆蟲(chóng)的腸道、淋巴、唾腺等組織內(nèi)的單細(xì)胞原核生物[2]。世界各地已報(bào)道植原體可引起1 000余種植物的系統(tǒng)性病害，危害多種果樹(shù)、蔬菜、花卉和林木等[3]。櫻桃植原體病害主要包括櫻桃黃化致死病[4]、櫻桃衰退病[5]、櫻桃花變綠或葉病[6-7]、櫻桃X病[8]、櫻桃叢枝病[9]，嚴(yán)重影響櫻桃的生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2018年以來(lái)，在桐梓縣、大方縣、修文縣、貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大面積自然花變?nèi)~、叢枝等疑似植原體感染的櫻桃植株，萬(wàn)艷等[10]報(bào)道貴州省畢節(jié)市櫻桃發(fā)生花變?nèi)~、花變綠、叢枝等植原體侵染的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響櫻桃產(chǎn)量。

植原體傳播快，危害大，尚無(wú)有效的化學(xué)防治手段，因此建立植原體檢測(cè)技術(shù)對(duì)植原體病害的防控具有重要意義。早期植原體檢測(cè)主要是根據(jù)植株感病所表現(xiàn)的特有癥狀、組織切片觀察或通過(guò)噴灑、注射植原體敏感的抗生素[11-12]，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果的可信度低。隨著技術(shù)的進(jìn)步，電子顯微鏡法、組織化學(xué)法、血清學(xué)方法、PCR法和核酸雜交法等大大提高了檢測(cè)效率，目前，PCR檢測(cè)方法是應(yīng)用最為廣泛的植原體檢測(cè)方法，此方法靈敏度高、且能快捷簡(jiǎn)便地檢測(cè)植物病原。

20世紀(jì)80年代，Woese等[13]提出了利用16 S rDNA保守基因序列作為植原體分類(lèi)的方法，隨之更多的學(xué)者基于16 S rDNA基因序列對(duì)植原體進(jìn)行分類(lèi)。16 S rDNA序列是原核生物染色體基因組上進(jìn)化過(guò)程中高度保守的一段rDNA編碼區(qū)序列，目前，植原體的物種命名主要基于16 S rDNA序列在植原體中的差異性[14]，通過(guò)植原體的通用引物和特異性引物擴(kuò)增出的16 S rDNA序列，是植原體鑒定、分類(lèi)、劃分組和亞組的主要參考依據(jù)。

本研究?jī)?yōu)化了適合貴州櫻桃的巢式PCR植原體檢測(cè)體系，同時(shí)對(duì)貴州省7個(gè)主要櫻桃產(chǎn)區(qū)的86份樣品進(jìn)行植原體分子檢測(cè)，對(duì)獲得的植原體16 S rDNA序列進(jìn)行親緣關(guān)系分析，明確病原菌的分布及分類(lèi)地位，旨在為貴州省櫻桃植原體病害防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

2020年6—8月在貴州省福泉市、六枝特區(qū)、大方縣、納雍縣等地采集86個(gè)櫻桃植株的葉片，液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 櫻桃葉片總DNA的提取

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP 320-02，天根生化科技有限公司)提取86份櫻桃葉片的總DNA，利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific USA)和1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)總DNA樣品濃度和純度，合格的總DNA立即存放于-20 ℃冰箱，備用。

1.3 植原體的巢氏PCR分子檢測(cè)

1.3.1引物選擇及合成

采用植原體16 S rDNA序列的通用引物對(duì)R 16 mF 2/R 16 mR 2和R 16 F 2 n/R 16 R 2[14-15]，引物經(jīng)上海生工生物工程公司合成。引物序列具體如下：

表1 植原體 16 S rDNA 基因序列的通用引物對(duì)

1.3.2PCR反應(yīng)體系及程序的優(yōu)化

利用提取的DNA為模版，外側(cè)引物對(duì)R 16 mF 2/R 16 mR 2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)體系及程序優(yōu)化，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置初始PCR反應(yīng)體系為：反應(yīng)模板1.0 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，5 U/μLTapDNA 聚合酶0.25 μL，10 μmol/L正反引物各1.0 μL，添加ddH2O至體系為20 μL。初始PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。對(duì)PCR反應(yīng)體系中的以下各項(xiàng)條件進(jìn)行單因素逐步優(yōu)化：

1) 2.5 mmol/L dNTP用量設(shè)置8個(gè)梯度，分別為：0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL、1.4 μL、1.6 μL、1.8 μL；

2) 5 U/μLTaqDNA聚合酶用量設(shè)置8個(gè)梯度，分別為：0.1 μL、0.15 μL、0.2 μL、0.25 μL、0.3 μL、0.35 μL、0.4 μL、0.45 μL；

3) 10 μmol/L引物的用量設(shè)置9個(gè)梯度，分別為：0.1 μL、0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL、0.9 μL、1.1 μL、1.3 μL、1.5 μL、1.7 μL；

4) 反應(yīng)條件退火溫度設(shè)置10個(gè)梯度，分別為：48 ℃、50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃，每個(gè)條件重復(fù)3次，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3巢氏PCR檢測(cè)

以提取總DNA作為模板，瑪瑙紅櫻桃組培苗DNA作為陰性對(duì)照，利用外側(cè)引物對(duì)R 16 mF 2/R 16 mR 2進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，以第一次PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物稀釋10倍為模板，內(nèi)側(cè)引物對(duì)R 16 F 2 n/R 16 R 2為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，兩次PCR反應(yīng)體系及程序均采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系及程序。

1.4 目的序列的克隆、測(cè)序及分析

利用DNA凝膠回收試劑盒(TDP 209-02，天根生化科技有限公司)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后，把產(chǎn)物連接至pEASY-Blunt cloning載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5 ɑ(北京全式金生物技術(shù)有限公司)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有卡那霉素(Kanamycin，Kan)的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取PCR檢測(cè)含有目標(biāo)條帶的陽(yáng)性克隆菌樣，送上海生工生物工程公司測(cè)序。將獲得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用 DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，通過(guò)MEGAX 64軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用 iPhyClassifier在線工具對(duì)獲得的16 S rDNA序列進(jìn)行虛擬的RFLP分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系及程序優(yōu)化

優(yōu)化后PCR的反應(yīng)體系為：反應(yīng)模板1.0 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.0 μL，5 U/μLTapDNA聚合酶0.2 μL，10 μmol/L正反引物各0.5 μL，添加ddH2O至體系為20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 40 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

2.1.1dNTP濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

從圖1可知，dNTP的濃度較低時(shí)，PCR擴(kuò)增的效果不理想，隨著濃度增加，條帶逐漸明亮，但濃度過(guò)高也會(huì)抑制反應(yīng)，其中以在泳道3和泳道4中擴(kuò)增出的條帶清晰明亮。由此，本實(shí)驗(yàn)選擇2.5 mM dNTP的用量為1.0 μL。

注:M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000,下同；1～8為dNTP用量(0.4～1.8 μL，按0.2 μL遞增)。

2.1.2TaqDNA聚合酶濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

如圖2所示，隨著TaqDNA聚合酶濃度的增加，擴(kuò)增出的條帶逐漸變得清晰明亮，泳道3～9條帶都較清晰，本實(shí)驗(yàn)選擇5 U/μLTaqDNA聚合酶用量為0.2 μL。

注:1～9為T(mén)aqDNA 聚合酶用量(0.1～0.5 μL，按0.05 μL遞增)。

2.1.3引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

結(jié)果如圖3所示，除了在泳道1中未擴(kuò)增出條帶外，從第2泳道開(kāi)始均有目的條帶的出現(xiàn),泳道3條帶明亮清晰，本實(shí)驗(yàn)選擇引物用量(10 μmol/L)為0.5 μL。

注:1～9為引物用量(0.1～1.7 μL，按0.2 μL遞增)。

2.1.4退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

從圖4可知，溫度在48 ℃至62 ℃均有目標(biāo)條帶的擴(kuò)增，當(dāng)溫度達(dá)到64 ℃以上時(shí)，沒(méi)有目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，而在58 ℃時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰明亮，且無(wú)非特異性條帶擴(kuò)增，因此本實(shí)驗(yàn)最佳溫度選擇58 ℃。

注:1～10為退火溫度(48～66 ℃，按2 ℃遞增)。

2.2 田間樣品檢測(cè)結(jié)果

利用優(yōu)化的巢式PCR方法對(duì)貴州省不同地方的86份樣品進(jìn)行分子檢測(cè)，在86份櫻桃樣品中有52份擴(kuò)增出約1.2 kb的特異性條帶(圖5)，如表2所示，除了六枝的樣品未檢測(cè)到植原體外，其他采樣點(diǎn)的樣品均呈陽(yáng)性，其中納雍縣、福泉市、貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)樣品檢出率高達(dá)100%，威寧縣、沿河縣、大方縣分別為40.74%、66.67%和40.00%。

表2 貴州櫻桃植原體分子檢測(cè)結(jié)果

注:1～16為納雍樣品；17為健康組培苗。

2.3 16 S rDNA序列的測(cè)定及同源性分析

將PCR擴(kuò)增出來(lái)的特異條帶進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序。分別獲得長(zhǎng)度為1 251 bp及1 255 bp的擴(kuò)增片段，分別命名為GZ-1，GZ-2。在NCBI上進(jìn)行同源性比較，結(jié)果(表3)表明，GZ-1、GZ-2植原體序列與榆樹(shù)黃化植原體組(Elm yellows，16 Sr V)同源性均在 97.93% 以上，與其他組植原體同源性介于88.16%～94.97%之間，相對(duì)較低，說(shuō)明所得序列屬于植原體16 Sr-V組。GZ-1植原體序列與16 Sr V-B組的甜櫻桃花變綠植原體(登錄號(hào)：MF 848961)和棗瘋病植原體分離物(登錄號(hào)：AB 052876)同源性分別達(dá)到99.36%和99.43%；GZ-2同16 Sr V-B組的中國(guó)櫻桃花變?nèi)~(登錄號(hào)：JN 607240)和棗瘋病植原體分離物(登錄號(hào)：AB 052876)同源性分別為99.20%、99.27%，表明獲得的植原體序列與植原體16 Sr V-B亞組同源性最高。

表3 貴州櫻桃植原體同16 Sr各組植原體16 S rRNA基因片段的核苷酸序列比較

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將本研究獲得的GZ-1、GZ-2植原體序列與已報(bào)道的22條不同組的植原體序列進(jìn)行比較，通過(guò)MEGAX 64軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖6)。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，獲得的序列與桃樹(shù)黃化病、棗瘋病等16 Sr V組的植原體劃分在同一分枝上，與同源性分析結(jié)果相一致，表明GZ-1、GZ-2植原體序列屬于16 Sr V組。GZ-1植原體序列同16 Sr V-B亞組的棗瘋病、甜櫻桃花變綠、櫻桃花變?nèi)~病聚為一枝，說(shuō)明GZ-1序列應(yīng)當(dāng)屬于16 Sr V-B亞組；而GZ-1與16 Sr V各亞組均未聚到同一枝上，形成獨(dú)立的一枝，表明GZ-2植原體有可能為新的亞組。

圖6 基于植原體16 S rDNA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表4 貴州櫻桃植原體及16 Sr V組的各亞組植原體株系的相似系數(shù)分析

2.5 虛擬RFLP分析

利用植原體的分類(lèi)鑒定iPhyClassifier在線軟件對(duì)獲得的GZ-1、GZ-2的序列進(jìn)行虛擬RFLP分析及相似系數(shù)分析，結(jié)果顯示，GZ-1序列與16 Sr V-B亞組中代表株系棗瘋病植原體(登錄號(hào):AB 052876)、甜櫻桃花變綠(登錄號(hào):MF 848961)櫻桃花變?nèi)~(登錄號(hào):JN 607240)相似系數(shù)分別為1.00，1.00、0.98，且GZ-1序列的在線酶切圖譜與棗瘋病植原體圖譜結(jié)果完全相同(見(jiàn)圖7)，確定GZ-1序列屬于16 Sr V-B亞組；GZ-2的在線酶切圖譜不同于16 Sr V組的任何亞組，與16 Sr V-B亞組相似系數(shù)最高為 0.97(F≤0.97)。依據(jù) Wei等[13]對(duì)植原體亞組劃分的規(guī)定，建議將GZ-2植原體命名為新的亞組。

注：A為GZ-1模擬16 S rRNA-RFLP酶切圖；B為GZ-2 模擬16 S rRNA-RFLP酶切圖；C為棗瘋病植原體模擬酶切圖。

3 討 論

植原體已經(jīng)成為嚴(yán)重危害櫻桃產(chǎn)業(yè)的病害之一，該病害可通過(guò)多種昆蟲(chóng)介體進(jìn)行傳播，傳播范圍廣泛，目前未見(jiàn)非常有效的治療手段，所以建立一套植原體檢測(cè)方法，用以開(kāi)展早期病害調(diào)查、檢測(cè)，及時(shí)鏟除病樹(shù)病枝，加強(qiáng)苗木調(diào)運(yùn)的檢疫，對(duì)防止病害流行十分必要?，旇Ъt櫻桃因其甜度高，耐儲(chǔ)運(yùn)等特點(diǎn)，是目前唯一走出貴州省并遠(yuǎn)銷(xiāo)北上廣等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的品種，在珠三角地區(qū)深受消費(fèi)者喜愛(ài)，具有了一定的品牌知名度，近幾年來(lái)，種植面積迅速增加，但目前基本都采用高枝壓條育苗方式，苗木流通也比較粗放，沒(méi)有嚴(yán)格的檢疫檢驗(yàn)流程，這也會(huì)增加植原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。本研究?jī)?yōu)化了櫻桃植原體16 S rDNA巢氏PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠，同時(shí)利用此優(yōu)化的檢測(cè)方法對(duì)貴州省7個(gè)櫻桃主產(chǎn)區(qū)的瑪瑙紅及黑珍珠櫻桃進(jìn)行檢測(cè)，在6個(gè)產(chǎn)區(qū)內(nèi)都檢測(cè)出植原體，這表明植原體病害在貴州省已普遍存在，開(kāi)展相應(yīng)的植原體病害防控已經(jīng)十分緊迫，如加強(qiáng)離多發(fā)地區(qū)較近果園的防控措施，開(kāi)展傳播介體調(diào)查，加強(qiáng)苗木流通檢疫，進(jìn)行脫植原體苗木培育等。

據(jù)報(bào)道，有6種不同的植原體導(dǎo)致櫻桃感病，根據(jù)其16 Sr RNA基因序列的RFLP分析，這些已知的櫻桃植原體屬于5個(gè)不同的核糖體群，即16 Sr Ⅰ、16 Sr Ⅲ、16 Sr Ⅴ、16 Sr Ⅹ和 16 Sr Ⅻ[16]。目前，四川及山東泰安、重慶等地的櫻桃黃化、花變綠、花變?nèi)~植株內(nèi)檢測(cè)到了16 Sr V-B亞組植原體[17-19]，同時(shí)在山東煙臺(tái)采集到的表現(xiàn)花變綠癥狀的櫻桃上還檢測(cè)到了16 Sr I-B亞組植原體[20]。16 Sr V-B亞組植原體主要發(fā)生在亞洲[21]，該亞組植原體在我國(guó)普遍出現(xiàn)，是棗瘋病、杏退綠卷葉病、紫花苜蓿叢枝病等病害的致病源。感染櫻桃的植原體類(lèi)型多樣，在美國(guó)發(fā)現(xiàn)有16 Sr Ⅲ組[22]，立陶宛發(fā)生的酸櫻桃黃化植原體屬于16 Sr Ⅰ組[23]，捷克發(fā)現(xiàn)有16 Sr Ⅹ組[24]，保加利亞發(fā)現(xiàn)有16 Sr Ⅻ組[25]，伊朗發(fā)現(xiàn)有16 Sr Ⅱ組[26]。本研究通過(guò)對(duì)獲得的植原體序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)獲得的2條序列都屬于16 Sr Ⅴ組，其中GZ-1植原體序列屬于16 Sr V-B亞組成員， GZ-2序列為16 Sr Ⅴ組新的亞組，表明目前感染貴州櫻桃的植原體與國(guó)內(nèi)其他區(qū)域基本一致，通過(guò)確定貴州櫻桃植原體病害的分類(lèi)學(xué)地位，對(duì)其病害傳播追溯、防控有重要意義。