郭宇峰 高興強(qiáng) 鄧海燕 劉美蓮 陸旖

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是易感個(gè)體接觸變應(yīng)原后由特異性IgE 介導(dǎo)的鼻黏膜的非感染性炎性疾病。AR患病率在全球范圍內(nèi)逐年上升，患病率為2.2%～45.1%。我國(guó)AR發(fā)病率也在不斷升高，我國(guó)成人AR自報(bào)平均患病率則為11.4%,中國(guó)同齡兒童AR患病率為10.4%，并且每年以0.33%的速度上升[1-2]。對(duì)于變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病的機(jī)制尚無(wú)定論，目前研究熱點(diǎn)包括遺傳基因的影響、免疫功能紊亂及環(huán)境因素等方面。近年來(lái)對(duì)AR致病基因的研究發(fā)現(xiàn)有多個(gè)與它相關(guān)的候選基因區(qū)。美國(guó)學(xué)者Dixit等[3]發(fā)現(xiàn)了一種具有高度生物活性的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，命名為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）。大 量 研究表明，TNFAIP3作為促炎因子核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的負(fù)調(diào)控因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的保護(hù)因素之一[4-6]。TNFAIP3近年來(lái)成為治療炎癥性疾病的潛在靶點(diǎn)而受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)在2019年1月—2020年1月開展，利用變應(yīng)性鼻炎大鼠模型，在其致敏-治療過(guò)程中研究TNFAIP3基因在鼻腔黏膜上皮的表達(dá)，研究其與變態(tài)反應(yīng)進(jìn)程的關(guān)系，為探討TNFAIP3在免疫進(jìn)程中的作用、能否作為AR治療的新思路提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，普通級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量250～300 g。購(gòu)自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部代養(yǎng)。該研究獲得廈門市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組，每組8只。

1.2 動(dòng)物模型的建立與模型評(píng)價(jià)

AR大鼠（取16只）參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行建模。基礎(chǔ)致敏階段：造模大鼠每只以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國(guó)Sigma，貨號(hào)A5503-1G）0.3 mg作抗原，氫氧化鋁粉末（美國(guó)Sigma貨號(hào)239186-25g）30 mg作為佐劑，加生理鹽水1 mL形成混懸液腹腔注射；隔日1次，共7次（第1～14天的單數(shù)日）。加強(qiáng)致敏階段：腹腔注射完成后，每只大鼠以0.25%卵清蛋白生理鹽水霧化吸入10 min，1次/d，連續(xù)5 d（第15～19天）。激發(fā)階段：間歇3 d后，以10%卵清蛋白用微量加樣器滴入大鼠雙側(cè)鼻腔，20 μL/次，1次/d，共7次（第23～29天）。打噴嚏和撓鼻次數(shù)在最后一次激發(fā)結(jié)束后10 min進(jìn)行計(jì)數(shù)。治療組（8只）：模型組中選擇8只做治療組，給予西替利嗪滴劑（商品名：仙特明；生產(chǎn)企業(yè)：UCB Pharma S.p.A意大利；批準(zhǔn)文號(hào)：進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20110137；規(guī)格：10 mL∶100 mg），1次/d，每次20 μL滴鼻，連續(xù)2周。模型組（8只）：除治療組外的剩余AR大鼠給與生理鹽水滴鼻。對(duì)照組（8只）：全程只用生理鹽水（正常組）。

AR大鼠模型主要表觀指標(biāo)：（1）出現(xiàn)擦鼻、噴嚏、流涕、鼻塞等局部過(guò)敏癥狀；（2）滴鼻激發(fā)后癥狀明顯增加；（3）按過(guò)敏反應(yīng)行為的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。表觀指標(biāo)可量化積分或半量化分級(jí)。噴嚏次數(shù)：1～3次為1分，4～10次為2分，≥11次為3分；抓鼻次數(shù)：1～4次為1分，4次以上為4分；清涕：流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。進(jìn)行積分累加，其癥狀觀察時(shí)間為每次給致敏物開始計(jì)時(shí)，共30 min，總評(píng)分≥5分判定為成功致敏。

1.3 大鼠鼻腔黏膜標(biāo)本的獲取

殺死大鼠，先取鼻中隔黏膜，將鼻部中間往上剪開，暴露鼻甲，鑷子從鼻中插入，向上掀開鼻甲骨，找到鼻中隔，小心剝離兩側(cè)附著的黏膜，一份固定做免疫組化，一份-80℃凍存。

1.4 組織病理學(xué)分析

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同處理組的24個(gè)大鼠鼻腔黏膜組織的NF-κB、TNFAIP3的表達(dá)情況。大鼠鼻腔黏膜組織用4%多聚甲醛固定，流水滴洗，經(jīng)不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯進(jìn)行組織透化后石蠟進(jìn)行包埋，包埋后的蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片。按抗體說(shuō)明書條件NF-κB、TNFAIP3均以檸檬酸修復(fù)液（pH 6.0）煮沸修復(fù)15 min；免疫組化油筆在組織周圍3～5 mm處畫圈，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，5 min/次；阻斷、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；正常羊血清工作液封閉非特異位點(diǎn)；按各抗體工作濃度稀釋抗體，滴加一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察顯色情況，自來(lái)水充分沖洗結(jié)束顯色；蘇木素復(fù)染5 min，流水沖洗，自來(lái)水浸洗5 min返藍(lán)；脫水透明，中性樹膠封片。并應(yīng)用蘇木素-伊紅染色（HE染色）后光鏡下觀察檢測(cè)鼻黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞的分布情況。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）對(duì)各組動(dòng)物鼻黏膜樣本中NF-κB和TNFAIP3基因mRNA的含量進(jìn)行檢測(cè)（引物序列見表1），實(shí)驗(yàn)按照實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒所規(guī)定的步驟進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用ΔCT法表示。

表1 qPCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Graphpad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，樣本量較小，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間差異的比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR大鼠模型的建立

AR組大鼠可見擦鼻、噴嚏、流涕、鼻塞等局部過(guò)敏癥狀；滴鼻激發(fā)后癥狀明顯增加；評(píng)分總分均≥5分。模型組平均評(píng)分（6.31±0.57）分，明顯高于正常組的（0.92±0.18）分及治療組的（1.35±0.51）分，模型組與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=56.11，P＜0.01），模型組與治療組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=32.70，P＜0.01），說(shuō)明AR大鼠模型建立成功。

2.2 組織病理學(xué)變化

嗜酸性粒細(xì)胞染色主要是檢測(cè)樣本組織中嗜酸性粒細(xì)胞的存在和分布情況，對(duì)照組和治療組的所有組織切片中未觀察到嗜酸性粒細(xì)胞的存在，模型組部分組織中存在嗜酸性粒細(xì)胞密集分布的情況（如圖1）。

圖1 大鼠鼻中隔黏膜組織上皮嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況（HE染色，×400）

進(jìn)行免疫組化NF-κB指標(biāo)檢測(cè)的樣本切片閱片可見模型組切片陽(yáng)性顯色密集，治療組有陽(yáng)性顯色，對(duì)照組僅有散在的陽(yáng)性顯色，各組切片有明顯差異（如圖2）。

圖2 大鼠鼻中隔黏膜NF-κB胞漿表達(dá)情況（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法，×400）

免疫組化TNFAIP3指標(biāo)檢測(cè)的樣本切片閱片可見治療組與對(duì)照組切片均有較密集的陽(yáng)性顯色，兩組間對(duì)比差異不大，模型組呈陰性表達(dá)，模型組對(duì)比治療組與對(duì)照組有顯著差異（如圖3）。

圖3 大鼠鼻中隔黏膜TNFAIP3胞漿表達(dá)情況（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法，×400）

2.3 鼻黏膜組織中NF-κB、TNFAIP3基因在對(duì)照組、模型組及治療組中的表達(dá)水平

模型組TNFAIP3基因表達(dá)水平（4.601±0.796）、對(duì)照組（7.430±1.026）、治療組（7.175±0.804）；模型組比對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.178，P＜0.05）；模型組比治療組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.274，P＜0.05）；治療組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.195，P＞0.05）。模型組NF-κB基因表達(dá)水平（6.046±0.665）、對(duì)照組（3.498±0.663）、治療組（4.056±0.333），模型組比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.714，P＜0.05），模型組比治療組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.677，P＜0.05），治療組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.175，P＞0.05）。

3 討論

變應(yīng)性鼻炎是以清水樣鼻涕、鼻塞等臨床表現(xiàn)為主，可伴眼部癥狀及耳部癥狀，不危及生命，但會(huì)顯著影響患者的生活質(zhì)量。隨著近年來(lái)對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，對(duì)AR致病基因的研究發(fā)現(xiàn)有多個(gè)與它相關(guān)的候選基因區(qū)，NF-κB是研究的熱點(diǎn)之一，NF-κB的激活使變態(tài)反應(yīng)炎癥因子級(jí)聯(lián)放大，形成炎癥風(fēng)暴，眾多文獻(xiàn)證明其在AR中起關(guān)鍵作用[8-9]。TNFAIP3蛋白同時(shí)具有泛素化以及去泛素化兩種功能，作為NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，是機(jī)體炎癥反應(yīng)的保護(hù)因素之一[10]。早期細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)持續(xù)過(guò)表達(dá)的TNFAIP3可顯著抑制NF-κB的激活，降低NF-κB靶基因的表達(dá)，包括細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）,白介素-8（interleukin-8，IL-8），核因子κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）組織因子，血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）以及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）。TNFAIP3負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB的生物活性，主要是通過(guò)抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）途徑和Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[11-12]。TNFAIP3基因敲除小鼠模型證明了其在炎癥負(fù)調(diào)控中的重要作用，TNFAIP3-/-小鼠在出生后不久即死于多器官的嚴(yán)重炎癥和組織多發(fā)損傷，包括肝臟、腎臟、腸道、關(guān)節(jié)及骨髓等[13]。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP3蛋白過(guò)表達(dá)可抑制由TNF，白介素-1（interleukin-1，IL-1）及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后核轉(zhuǎn)錄激活因子-1（activator protein-1，AP-1）的激活從而改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥表現(xiàn)。TNFAIP3近年來(lái)成為治療炎癥性疾病的潛在靶點(diǎn)而受到關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化發(fā)現(xiàn)AR大鼠模型組鼻黏膜組織中炎癥因子NF-κB指標(biāo)陽(yáng)性顯色，RT-PCR檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)鼻腔黏膜組織中NF-κB基因表達(dá)在模型組中高于治療組與對(duì)照組。NF-κB作為炎癥和免疫反應(yīng)的樞紐因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，在變態(tài)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠鼻黏膜免疫組化TNFAIP3指標(biāo)檢測(cè)治療組與對(duì)照組切片均有較密集的陽(yáng)性顯色，而模型組為陰性表達(dá)，兩者對(duì)比有顯著差異。RT-PCR檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)TNFAIP3 mRNA在模型組中低于治療組與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TNFAIP3作為促炎因子NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，其水平下降意味著對(duì)NF-κB的負(fù)調(diào)控能力下調(diào)，后者升高可帶來(lái)一系列嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，即模型組小鼠出現(xiàn)明顯的噴嚏、流涕等變應(yīng)性炎癥癥狀。本實(shí)驗(yàn)治療組TNFAIP3的表達(dá)較模型組明顯增高，而NF-κB降低，大鼠鼻腔炎癥反應(yīng)減輕。說(shuō)明TNFAIP3升高可下調(diào)NF-κB因子水平來(lái)降低氣道高反應(yīng)性并抑制氣道炎癥因子級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)。

隨著遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為變應(yīng)性鼻炎的多種表現(xiàn)型都處于較強(qiáng)的遺傳控制之下，是一種具有多基因遺傳傾向的疾??；目前已知基因如IL-23R、MRPL4及TNF-α的SNP均與AR易感性有關(guān)[15]。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)TNFAIP3基因多態(tài)性與漢族人群AR遺傳易感性有關(guān)，楊盈琳等發(fā)現(xiàn)TNFAIP3基因的rs9494885SNP位點(diǎn)及rs7753873SNP位點(diǎn)與AR遺傳易感性密切相關(guān)[16]。且有研究報(bào)道在AR人群中鼻黏膜TNFAIP3基因和蛋白的表達(dá)水平較健康對(duì)照組降低，與本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究指標(biāo)一致[17]。除外變應(yīng)性疾病，國(guó)內(nèi)外較多文獻(xiàn)報(bào)道在各類自身免疫病及炎癥疾病人群中TNFAIP3的表達(dá)均較正常人群低。如Bruno等[18]發(fā)現(xiàn)在克羅恩病患者中，炎性結(jié)腸黏膜組織的TNFAIP3基因表達(dá)低于健康對(duì)照者；Wang等[19]發(fā)現(xiàn)TNFAIP3蛋白表達(dá)的下降與歐洲和韓國(guó)人群中SLE的發(fā)病呈顯著相關(guān)；魏潔瓊等[20]發(fā)現(xiàn)甲亢組外周血中鋅指蛋白TNFAIP3mRNA 表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，低水平的TNFAIP3表達(dá)可能在甲亢Graves病發(fā)生發(fā)展免疫應(yīng)答中起到作用。但在國(guó)內(nèi)也有文獻(xiàn)報(bào)道AR模型小鼠鼻黏膜中TNFAIP3mRNA和蛋白表達(dá)水平增高，作者推測(cè)急性炎癥誘導(dǎo)了TNFAIP3的表達(dá)，從而抑制NF-κB的炎癥反應(yīng)[21]。此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相反，可能為炎癥急性期TNFAIP3在鼻黏膜中表現(xiàn)出應(yīng)激性增高，隨著炎癥的進(jìn)展，TNFAIP3的表達(dá)逐漸降低。

綜上所述，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生發(fā)展與許多炎癥因子密切相關(guān)。其中鋅指蛋白TNFAIP3作為炎癥觸發(fā)因子NF-κB的負(fù)調(diào)控因素，為阻止機(jī)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)發(fā)揮了不可替代的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)一步證明了TNFAIP3的作用，為變應(yīng)性疾病的預(yù)防和治療提供了新的思路。