陳偉意 史聰穎 李佩瑤 馬天寶 顏紅金 韋燕 魏偉

長久以來，臍帶血被認為是生物廢物直接丟棄，隨著科學(xué)研究的不斷進步，自1988年法國開展了世界上首例同胞臍帶血移植治療范可尼貧血以后，人們才漸漸意識到臍帶血的重要性。除了進行造血干細胞移植治療血液類疾病，重建造血、免疫系統(tǒng)，臍帶血也被廣泛應(yīng)用于遺傳病、代謝病、免疫病及再生醫(yī)學(xué)（尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷）的臨床治療和研究[1]。目前，全世界臍帶血造血干細胞保存量已超過600 000份，臨床應(yīng)用量已超過30 000例[2]。 臍血中含有比骨髓中造血干細胞更豐富更原始的、具有擴增能力的造血干細胞,其優(yōu)點是來源廣泛、采集簡單,目前是繼骨髓和外周血后的第三大造血干細胞來源[3]。但臍帶血采集難免會有微生物污染的風險，受污染的血液如果進入到患者體內(nèi)將會產(chǎn)生嚴重的后果，因此微生物檢測為陰性是臍帶血造血干細胞符合臨床應(yīng)用標準的條件之一[4]。 在不同分娩方式里，順產(chǎn)后采集的臍帶血，其受污染的可能性是最高的[5-6]。因此，嚴格規(guī)范產(chǎn)后臍帶血采集消毒操作方式，是降低臍帶血采集時的微生物污染率的最重要一環(huán)。本研究利用單盲隨機對照的方式研究臍帶消毒方式對臍帶血污染率和臍帶血質(zhì)量的影響，為降低臍帶血污染率提供了一種新的、可行性強的臨床臍帶血采集方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5—12月在廣州市南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀念醫(yī)院產(chǎn)科分娩的400例孕婦。采用單盲隨機對照的方法，把納入的孕婦隨機分成試驗組與對照組，各200例，納入標準：（1）孕產(chǎn)婦年齡18～45歲；（2）簽署臍帶血自存知情同意書；（3）孕產(chǎn)婦的信息記錄完整。排除標準：（1）產(chǎn)前經(jīng)醫(yī)生評估后不適合術(shù)中采集臍帶血的高危孕產(chǎn)婦；（2）已知造成宮內(nèi)感染的孕婦。剔除標準：（1）采集的臍血中有凝塊或異物；（2）臍帶血采集信息表填寫不完整的臍帶血；（3）穿刺2次及以上采集到的臍帶血；（4）含有臍血的采血袋在檢測前破裂或有臍血漏出；（5）實驗室處理臍血過程中導(dǎo)致污染的臍血。該試驗的實施已獲醫(yī)院倫理委員會同意。所有病例資料采集均獲得孕婦同意，并簽署試驗知情同意書。記錄整理產(chǎn)婦的年齡，分娩結(jié)局及新生兒體質(zhì)量作為一般資料，兩組產(chǎn)婦的年齡、分娩結(jié)局和新生兒體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組產(chǎn)婦及新生兒一般資料比較

1.2 方法

試驗組：陰道分娩時，應(yīng)先在采血臺上鋪一張無菌巾，將臍帶放在無菌巾上，然后開始消毒采集臍帶血。用含碘伏的紗布或有尾紗條，包裹消毒整條臍帶1次，選擇胎盤斷端的臍帶4～5 cm位置作為穿刺部位，對穿刺部位再消毒2次，由臍帶胎盤斷端向胎盤方向擦拭穿刺點，不能來回擦拭（圖1）。

圖1 深度臍帶消毒方案步驟

對照組：使用常規(guī)消毒方案。陰道分娩時，使用75%的酒精棉球?qū)δ殠Т┐滩课幌?～2次，由臍帶胎盤斷端向胎盤方向擦拭穿刺點，不能來回擦拭。

臍帶血采集操作參照《臍帶血造血干細胞庫技術(shù)規(guī)范》[7]。穿刺操作在已經(jīng)消毒的穿刺部位上穿刺采集，選擇臍靜脈相對平直，充盈處作為穿刺點。用無菌紗布固定防滑脫，進行臍靜脈穿刺時，采血針尖斜面向下或偏向側(cè)面，如果臍靜脈相對平直，見血后針頭沿血管壁順行1～2 cm。讓臍帶血通過重力作用流入一次性采血袋內(nèi)，同時輕輕搖晃采血袋，以便血液與采血袋內(nèi)的抗凝劑充分混勻。臍帶血采集后，立即保存在0～4℃冰箱中，待廣東省臍帶血造血干細胞庫（以下簡稱廣東省臍血庫）工作人員統(tǒng)一收集并裝入血液運輸箱中（溫度保持在4～25℃），自臍帶血采集后36 h內(nèi)運輸至廣東省臍血庫。廣東省臍血庫在采集后48 h內(nèi)完成臍血的制備，通過程序降溫至-80 ℃后放置于液氮中保存。

1.3 觀察指標

1.3.1 單個核細胞計數(shù) 臍帶血到達廣東省臍血庫后，每份臍帶血由兩人復(fù)核信息，熱合去除采血針及多余管路后，血袋稱重并計算臍帶血量。每份臍帶血編碼其唯一的編號，然后對血袋表面進行消毒。臍帶血取1 mL全血血樣，在五分類血球計數(shù)儀（日本，Sysmex，XE-5000）機器下對有核細胞進行計數(shù)，測算總有核細胞數(shù)。臍帶血經(jīng)離心制備后，從濃縮后臍血樣本抽取約0.1 mL加入RPMI-1640培養(yǎng)液制備成稀釋約10倍的細胞懸液，充分混勻細胞懸液后取出200 μL于五分類血球計數(shù)儀下計算凍前有核細胞計數(shù)。

1.3.2 細菌污染陽性率 在萬級無菌操作室內(nèi)，臍帶血單個核細胞制備完后，將臍血分離出臍血血漿聯(lián)袋，抽取臍血血漿10 mL分別接種至需氧瓶和厭氧瓶，采用全自動細菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)7 d，檢測是否有細菌污染。

1.3.3 CD34+細胞含量及有核細胞活性分析 采用流式細胞術(shù)對制備后獲得的單個核細胞進行測定。流式細胞儀（FACSCalibur，BD公司）檢測已標記好的樣本，根據(jù)ISHAGE標準[7]，利用白細胞共同抗原-45（CD45）、白細胞共同抗原-34（CD34）單克隆抗體（CD45是有核細胞的特異性標志物，CD34是造血干祖細胞的特異性標志物）來對臍帶血進行檢測。根據(jù)造血干/祖細胞的4個特征[CD34陽性、CD45弱陽性、低前行散射光（SSC）、側(cè)向散射光（FSC）]圈選出造血干/祖細胞占有核細胞的含量，即得到CD34+細胞含量。根據(jù)細胞染色劑7-氨基放線菌素D（7-AAD）可使死細胞染色的原理來檢測臍帶血中活細胞占有核細胞的含量，即有核細胞活性。

1.3.4 CFU-GM集落細胞培養(yǎng)分析 臍帶血樣本抽取約0.1 mL加入RPMI-1640培養(yǎng)液制備成稀釋約10倍的細胞懸液，根據(jù)標本細胞懸液濃度及最終培養(yǎng)體系為3.3 mL，結(jié)合計算所需加入的甲基纖維素培養(yǎng)基及細胞懸液的各自體積，制成有核細胞終濃度定量為5×104個/mL的培養(yǎng)體系。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2、濕度＞95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束取出培養(yǎng)板在倒置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計每份臍帶血培養(yǎng)的3個孔的集落數(shù)，取其均值作為該份臍帶血的粒細胞及巨噬細胞集落形成單位（CFU-GM）的計數(shù)結(jié)果。＞40個細胞組成的細胞團確認為1個集落，只計CFU-GM、粒細胞巨噬細胞系集落生成單位（CFU-GEMM）、單核系集落形成單位（CFU-M）集落，不計紅細胞爆式集落形成單位（BFU-E）集落。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計的數(shù)據(jù)分組在進行數(shù)據(jù)分析前未對數(shù)據(jù)分析處理人員揭盲，數(shù)據(jù)分析完成后由項目負責人對數(shù)據(jù)分組進行揭盲。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0處理。計量數(shù)據(jù)的檢測結(jié)果以（±s）表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（n）和百分率（%）表示，予以χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

試驗組臍帶血細菌污染率為1.0%（2/200），低于對照組的臍帶血細菌污染率2.5%（5/200）。試驗組與對照組的臍帶血凍前有核細胞計數(shù)、CD34+細胞含量、凍前有核細胞活性和CFUGM細胞計數(shù)等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組對臍帶血質(zhì)量的影響指標對比（ x- ±s）

3 討論

臍帶血造血干細胞在臨床中主要用于治療血液病及血液腫瘤等[8]，現(xiàn)也已有開展多項治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的臨床試驗，如腦癱、自閉癥等[9-11]。臍帶血的臨床應(yīng)用都需要把臍帶血造血干細胞輸注到患者血液中，一旦病原生物通過污染的血液入侵人體，會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，嚴重者甚至?xí)＜盎颊咝悦?鑒于血液細菌污染的嚴重性，所有入庫的臍帶血都必須檢測為無菌的。臍血污染途徑存在3種可能：（1）產(chǎn)房采集過程中污染；（2）運輸途徑中污染；（3）實驗室處理過程中污染[6]。分離和采集是造成污染的主要因素，臍帶血細菌污染90%以上是由采集環(huán)節(jié)造成的[4]，因此臍帶消毒的方式對臍帶血采集的污染率至關(guān)重要。

本研究試驗組采用了含碘伏的紗布或有尾紗條作為消毒工具，相比于常規(guī)臍帶消毒的用酒精棉球，可以更好地對臍帶進行包裹，并可以全面地包裹抹擦臍帶已達到更為深度的消毒效果。對采集臍帶血的消毒步驟提出了質(zhì)量可控的標準化操作流程：包裹消毒整條臍帶1次，選擇胎盤斷端的臍帶4～5 cm位置作為穿刺部位，對穿刺部位再消毒2次，可以進一步可控地防治臍血污染的發(fā)生，斷絕污染途徑。目前國內(nèi)外并未有對臍帶血消毒方式是否會對臍帶血的污染率及臍帶血質(zhì)量產(chǎn)生影響的研究，本研究填補了這一空白。研究納入的兩組產(chǎn)婦年齡、新生兒體質(zhì)量的值沒有顯著差異，減少了其對臍帶血凍前有核細胞計數(shù)、CD34+細胞含量及CFU-GM的偏倚。同時納入的產(chǎn)婦陰道產(chǎn)及剖腹產(chǎn)的數(shù)量接近，也減少了不同分娩結(jié)局對臍帶血污染率不同的偏倚。研究結(jié)果表明，試驗組的污染率為1.0%，凍前有核細胞計數(shù)（7.43±4.13）×108個，凍前有核細胞活性（96.50±2.41）%，CD34+細胞含量（0.30±0.15）%，CFU-GM（102.07±36.89）/105個細胞數(shù)。對比對照組，試驗組細菌/霉菌的污染率下降1.5%，而與對照組凍前有核細胞數(shù)、CD34+細胞含量、有核細胞活性及CFU-GM的數(shù)值沒有顯著性差異，表明試驗組的消毒方式不會對臍帶血質(zhì)量造成影響。

本研究臍帶血的制備與保存均由廣東省臍血庫進行，廣東省臍血庫擁有符合美國病理學(xué)家協(xié)會（CAP）室間質(zhì)評標準的潔凈度達標的制備車間，并取得AABB美國血庫協(xié)會認證和ISO9001質(zhì)量管理體系認證。臍帶血采集采用的是三連袋，在臍帶血制備過程中，臍帶血不會與外界接觸，臍血的制備與分離能保證無菌環(huán)境。移植前對臍帶血的篩選，除了人類白細胞抗原（HLA）配型結(jié)果及血型以外，有核細胞數(shù)、CD34+細胞含量、有核細胞活性、細菌霉菌污染及CFU-GM集落計數(shù)都是評價臍帶血質(zhì)量的重要指標[12-14]。隨著臍帶血研究的不斷深入，未來臍帶血的應(yīng)用數(shù)量及范圍將逐步上升，在保證臍帶血質(zhì)量的同時降低臍帶血污染陽性率是提高臍帶血庫存量的關(guān)鍵。

本研究就臍帶消毒方式對臍帶血污染率及臍帶血質(zhì)量的影響進行研究，以確保臍帶血質(zhì)量的前提下，降低細菌污染陽性率。雖然試驗組細菌/霉菌的污染率僅下降1.5%，但對于全國臍血庫年采血量上百萬份的體量，污染率下降1.5%即可有效降低因污染而導(dǎo)致的人力物力成本損耗，對現(xiàn)實操作有重要意義。本研究存在研究樣本量的局限性，后續(xù)可繼續(xù)進行擴大樣本量研究。

綜上所述，試驗組的深度消毒方式不會對臍帶血的質(zhì)量產(chǎn)生影響，但是可有效降低臍帶血細菌污染率，值得臍帶血采集領(lǐng)域的關(guān)注。