周安付 譚琰 張惠晶

隨著結(jié)腸癌治療理念以及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)腸癌的治療已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但總體預(yù)后依然不理想［1］。因此，研究者不斷探索結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制并挖掘新的治療靶點(diǎn)，以期改善其預(yù)后。既往大量研究顯示，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，針對(duì)TME的治療策略也取得很大進(jìn)展［2］。中性粒細(xì)胞作為T(mén)ME的重要組成部分，也被發(fā)現(xiàn)參與了致癌生物學(xué)過(guò)程的不同階段，包括腫瘤的啟動(dòng)、增殖及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來(lái)源的外泌體可通過(guò)向TME中的免疫細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，形成轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位［4］。但腫瘤來(lái)源外泌體在中性粒細(xì)胞激活中的作用目前尚不明確。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是在小牛胸腺中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的核蛋白，也是多種惡性腫瘤外泌體的重要組成成分之一［5］。既往研究報(bào)道HMGB1可以刺激中性粒細(xì)胞形成中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）［6］，且 HMGB1 在結(jié)腸癌患者血清和癌組織中表達(dá)升高［7］。由此推測(cè)結(jié)腸癌外泌體可能通過(guò)HMGB1激活中性粒細(xì)胞。本研究旨在探討結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體是否通過(guò)HMGB1而在中性粒細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)揮作用，以期揭示結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；shRNA陰性對(duì)照（sh-NC）和HMGB1特異性shRNA（sh-HMGB1）購(gòu)自南京金斯瑞生物科技股份有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和SYTOX Green Nucleic Acid Stain Protocol購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；TransExoTMCell Media Exosome Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；中性粒細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；HMGB1抗體、TSG101抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex；CD63抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology；CD81抗體和GRP94抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；GAPDH抗體購(gòu)自愛(ài)必信（上海）生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

SW480和NCM460細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。每2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰酶液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或鋪板操作。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞以5×105/mL密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：SW480組（不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作）、sh-NC組（轉(zhuǎn)染sh-NC）、sh-HMGB1組（轉(zhuǎn)染sh-HMGB1）。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 外泌體分離和鑒定

收集SW480組、sh-NC組、sh-HMGB1組SW480細(xì)胞和NCM460細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)TransExoTMCell Media Exosome Kit說(shuō)明書(shū)分離各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體，分別命名為SW480-exo、sh-NC-exo、sh-HMGB1-exo、NCM460-exo。采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體粒徑，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白TSG101、CD63、CD81和細(xì)胞標(biāo)志性蛋白GRP94的表達(dá)。

1.4 中性粒細(xì)胞的分離及分組

收集2018年8月—2020年8月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的健康體檢者血液樣本，血液樣本的采集經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。中性粒細(xì)胞分離：向分離液中緩慢加入血液樣本，1 000 r/min離心30 min。吸取白膜中性粒細(xì)胞層至新的離心管內(nèi)，PBS清洗，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液；用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定中性粒細(xì)胞存活率和純度，存活率＞95%、純度＞95%表示中性粒細(xì)胞分離成功。分離成功的中性粒細(xì)胞分別添加PBS、NCM460-exo、SW480-exo、NCM460-exo、sh-NC-exo和sh-HMGB1-exo，外泌體添加量均為20 μg/mL，依次記為PBS組、NCM460-exo組、SW480-exo組、sh-NC-exo組和sh-HMGB1-exo組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌2次，加入含MNase（1 U/mL）酶的培養(yǎng)基，在37℃下孵育20 min；加入EDTA終止，離心取上清液，立即使用或置于-80℃條件下保存。

1.5 Sytox green染色檢測(cè)中性粒細(xì)胞NETs形成情況

收集各組中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，加入Sytox green染色液，室溫下避光孵育20 min后，棄去染色液。PBS再次清洗后，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞發(fā)光情況，用Image J軟件分析Sytox green熒光單位。

1.6 Western blot檢測(cè)HMGB1、TSG101、CD63、CD81和GRP94蛋白的表達(dá)水平

收集細(xì)胞和外泌體，采用RIPA裂解液裂解。離心收集上清液并測(cè)定其蛋白濃度。各組取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳以及轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，加入HMGB1（1∶1 000）、TSG101（1∶2 000）、CD63（1∶2 000）、CD81（1∶1 000）、GRP94（1∶1 000）和 GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4 ℃條件下孵育過(guò)夜；加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞隨機(jī)分為PBS+Neutrophils組、SW480-exo+Neutrophils組、sh-NC-exo+Neutrophils組和sh-HMGB1-exo+Neutrophils組，按照分組，添加對(duì)應(yīng)中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液（與新鮮培養(yǎng)基比例為1∶1）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞光密度（OD）值。細(xì)胞活力（%）=［（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（PBS+Neutrophils組OD值-空白組OD值）］×100%或者是細(xì)胞活力（%）=［（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（SW480-exo+Neutrophils組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，每皿接種300個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同CCK-8法。各組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2周，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min。移除固定液，加入吉姆薩染色液染色10 min后，流水沖洗，空氣干燥。肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲情況

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞接種于Transwell上室，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞分組及處理同CCK-8法；Transwell下室則加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，除所用Transwell小室預(yù)先用Matrigel包被外，其余操作步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的鑒定

用透射電鏡觀察結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的形態(tài)，結(jié)果顯示，SW480-exo呈圓形囊泡結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1A；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SW480-exo中TSG101、CD63、CD81蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，GRP94蛋白不表達(dá)；而SW480細(xì)胞中TSG101、CD63、CD81蛋白表達(dá)不明顯，GRP94蛋白明顯表達(dá)，見(jiàn)圖1B；納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示，SW480-exo平均直徑為100 nm，見(jiàn)圖1C。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體分離成功。

圖1 結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體的鑒定Fig.1 Identification of exosomes from colon cancer cells

2.2 結(jié)腸癌外泌體及中性粒細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460外泌體中HMGB1蛋白含量，結(jié)果顯示，SW480-exo中HMGB1蛋白含量明顯高于NCM460-exo（P=0.003），見(jiàn)圖2A。PBS和SW480-exo分別處理中性粒細(xì)胞后，SW480-exo組中性粒細(xì)胞中HMGB1蛋白的表達(dá)水平較PBS組明顯升高（P=0.001），見(jiàn)圖2B。

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌外泌體和中性粒細(xì)胞中HMGB1蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of HMGB1 protein in colon cancer exosomes and neutrophils detected by Western blot

2.3 SW480-exo對(duì)中性粒細(xì)胞NETs形成的影響

PBS、NCM460-exo或SW480-exo分別處理中性粒細(xì)胞后，用Sytox green染色檢測(cè)中性粒細(xì)胞NETs形成情況，結(jié)果顯示，與PBS組相比，NCM460-exo組中性粒細(xì)胞的Sytox green熒光單位無(wú)明顯變化（P=0.643），但SW480-exo組中性粒細(xì)胞Sytox green熒光單位明顯升高（P=0.006），見(jiàn)圖3。

圖3 Sytox green染色檢測(cè)中性粒細(xì)胞NETs形成（×400）Fig.3 Sytox Green staining for the formation of neutrophil NETs(×400)

2.4 經(jīng)SW480-exo處理的中性粒細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與PBS+Neutrophils組相比，SW480-exo+Neutrophils組SW480細(xì)胞活力（P=0.002）、克隆形成數(shù)（P=0.003）、遷移細(xì)胞數(shù)（P=0.004）和侵襲細(xì)胞數(shù)（P=0.006）均明顯升高，見(jiàn)圖4。

圖4 經(jīng)SW480-exo處理的中性粒細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of neutrophils treated with SW480-exo on colon cancer cells

2.5 sh-HMGB1-exo對(duì)中性粒細(xì)胞NETs形成的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，sh-NC和sh-HMGB1轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，sh-HMGB1組細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)較sh-NC組明顯降低（P=0.003），但SW480組與sh-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.728），見(jiàn)圖5A。表明敲低HMGB1的結(jié)腸癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

SW480-exo、sh-NC-exo和sh-HMGB1-exo處理中性粒細(xì)胞后，sh-HMGB1-exo組細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)（P=0.002）和Sytox green熒光單位（P=0.004）均較sh-NC-exo組明顯降低，但sh-NC-exo組與SW480-exo組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖5B～C。

圖5 sh-HMGB1-exo對(duì)中性粒細(xì)胞NETs形成的影響Fig.5 Effect of sh-HMGB1-exo on the formation of neutrophil NETs

2.6 經(jīng)sh-HMGB1-exo處理的中性粒細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sh-NC-exo+Neutrophils組相比，sh-HMGB1-exo+Neutrophils組SW480細(xì)胞活力（P=0.008）、克隆形成數(shù)（P=0.010）、遷移細(xì)胞數(shù)（P=0.007）和侵襲細(xì)胞數(shù)（P=0.005）均明顯降低，但SW480-exo+Neutrophils組無(wú)明顯變化（均P＞0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 經(jīng)sh-HMGB1-exo處理的中性粒細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響Fig.6 Effect of sh-HMGB1-exo-treated neutrophils on colon cancer cells

3 討論

中性粒細(xì)胞是人體循環(huán)中含量最豐富的白細(xì)胞，在炎癥和宿主防御微生物感染方面起著關(guān)鍵作用［8］。中性粒細(xì)胞通常被認(rèn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞有防御反應(yīng)，但最近的證據(jù)表明腫瘤調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能以支持腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展，且主要參與促進(jìn)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫抑制等［9］。有研究顯示，中性粒細(xì)胞可能通過(guò)趨化、吞噬、脫顆粒和形成NETs發(fā)揮其功能［10］。NETs是一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包含由中性粒細(xì)胞在一定刺激下排出的解聚DNA細(xì)絲和顆粒內(nèi)容物，可誘導(dǎo)一種不同于凋亡和壞死的新型細(xì)胞死亡［11］。NETs還含有豐富的促炎分子，且與各種無(wú)菌炎癥條件有關(guān)［12］。研究表明，中性粒細(xì)胞可通過(guò)NETs捕獲循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞而促進(jìn)細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散［13］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中的中性粒細(xì)胞水平升高與NETs形成及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［14］。然而，NETs在結(jié)腸癌微環(huán)境中的作用及機(jī)制并不清楚。近年來(lái)研究顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體作為細(xì)胞間通訊的信使，也是腫瘤發(fā)生的介質(zhì)。而靶向抑制外泌體可能是結(jié)直腸癌潛在的有效治療方法［15］。此外，還有證據(jù)顯示，結(jié)腸癌來(lái)源外泌體通過(guò)將突變的KRAS轉(zhuǎn)移到中性粒細(xì)胞，從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集和NETs形成，最終導(dǎo)致疾病惡化［16］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌來(lái)源外泌體SW480-exo處理中性粒細(xì)胞可誘導(dǎo)其NETs形成，進(jìn)一步將經(jīng)SW480-exo處理的中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液添加至結(jié)腸癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均升高，提示結(jié)腸癌來(lái)源外泌體可能通過(guò)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs的形成，進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

HMGB1作為腫瘤外泌體的成分之一，主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與癌癥進(jìn)展。如，LI等［17］報(bào)道食管鱗狀細(xì)胞癌來(lái)源的外泌體通過(guò)HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2表型轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)疾病進(jìn)展。肝細(xì)胞癌細(xì)胞來(lái)源外泌體也能通過(guò)HMGB1激活B細(xì)胞并促進(jìn)TIM-1+Breg細(xì)胞擴(kuò)增，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌免疫逃避和疾病進(jìn)展［18］。目前，已有證據(jù)顯示，HMGB1可能是NETs的重要組成部分。ZHA等［19］在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HMGB1能修飾NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的相關(guān)因子相互作用導(dǎo)致核因子NF-κB激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。還有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清HMGB1水平與中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，其中低氧原發(fā)腫瘤可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分泌HMGB1，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞CD62Ldim表型極化，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體中HMGB1含量明顯高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，且結(jié)腸癌來(lái)源外泌體SW480-exo可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)HMGB1和NETs形成，但用敲低HMGB1的結(jié)腸癌細(xì)胞外泌體sh-HMGB1-exo處理中性粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HMGB1表達(dá)下調(diào)且NETs形成減少；進(jìn)一步將sh-HMGB1-exo處理的中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入結(jié)腸癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞活力、增殖能力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均降低，與上述文獻(xiàn)［18-20］報(bào)道一致。說(shuō)明結(jié)腸癌來(lái)源外泌體可能通過(guò)HMGB1誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs的形成，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，結(jié)腸癌來(lái)源外泌體可能通過(guò)將HMGB1傳遞至中性粒細(xì)胞中并誘導(dǎo)NETs形成，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，HMGB1可能是潛在的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制，也為開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供了的思路。