郭懷斌，李鳳飛，劉一璠，張萬星，闞金龍

(1.河北省人民醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050051；2.河北北方學院研究生學院，河北 張家口 075000；3.河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；4.邯鄲鋼鐵集團有限責任公司職工醫(yī)院外科，河北 邯鄲 056001)

目前胰腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)的治療效果不佳，最有希望改善PDAC預(yù)后的方法是早發(fā)現(xiàn)、早治療[1]。檢測外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican-1，GPC-1)外泌體(exosomes)可用于早期發(fā)現(xiàn)并診斷PDAC[2]， GPC-1外泌體內(nèi)有Kras突變基因編碼的RNA片段[3]，原癌基因Kras突變是PDAC發(fā)病的重要原因[4]。分化抗原(cluster of differentiation，CD)82外泌體是一個新發(fā)現(xiàn)的PDAC標記物[5]；CA19-9是目前臨床常用的PDAC相關(guān)血清學腫瘤標志物，但其在PDAC診斷中的敏感度和特異度還達不到期望[6-7]。本研究旨在探討檢測外周血GPC-1外泌體、CD82外泌體和CA19-9對PDAC的診斷價值。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月—2018年6月于河北省人民醫(yī)院診斷為PDAC患者(PDAC組)31例和慢性胰腺炎患者(CP組)22例。PDAC組男性16例，女性15例，年齡34 ～78歲，平均(60.32±9.69)歲;CP組男性16例，女性6例，年齡28～82歲，平均(55.5±17.87)歲。2組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。PDAC納入標準：胰腺腫物行活組織檢查或手術(shù)切除后組織經(jīng)病理確診為PDAC。排除標準：①標本收取過程中出現(xiàn)溶血的標本；②二源性腫瘤患者。根據(jù)MELO SA的研究[1]，CP排除乳腺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，PDAC;③二源性腫瘤患者。CP診斷參照中華醫(yī)學會外科學分會胰腺外科學組的診斷標準[8]，排除乳腺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者。

本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會審批通過(批號：2017年科研倫理第131號)，所有納入患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2樣本采集 2組患者采集清晨空腹外周血5 mL，放到乙二胺四乙酸抗凝管中，30 min內(nèi)利用超高速離心機2 000 r/min(半徑6.4 cm)離心10 min，去除細胞，再用超高速離心機10 000 r/min(半徑6.4 cm)離心30 min，去除細胞碎片，剩余血漿，置于4 ℃低溫冰箱保存待測。

1.3分離外泌體 血漿于冰面上自然融化后，用×1的PBS緩沖液稀釋后過濾(孔徑0.22 μm)，濾液在4 ℃利用超高速離心機15 000 r/min(半徑16.5 cm)離心 12 h，得到外泌體微球，再用×1的PBS緩沖液洗滌，在4 ℃利用超高速離心機15 000 r/min(半徑16.5 cm)離心2 h，得到所需要的外泌體溶液。

1.4外泌體GPC-1抗原染色 采用免疫組織化學SP法，其基本原理為抗原抗體反應(yīng)和化學顯色原理。首先通過微球偶聯(lián)外泌體(exosome)，再用GPC-1抗體免疫結(jié)合外泌體上的GPC-1蛋白，孵育熒光二抗。先取外泌體溶液標本100 μL，利用4 μm醛/硫酸鹽乳膠微球偶聯(lián)外泌體，隨后利用anti-GPC-1抗體PA5-28055免疫結(jié)合外泌體上的GPC-1蛋白，最后孵育熒光二抗：滴加Alexa Fluor 488抗體(7.5 mg/L)，并使用顯示劑顯色。

1.5GPC-1外泌體和CD82外泌體測定 通過C6流式細胞儀檢測偶聯(lián)混合物的熒光強度，自動計算外泌體GPC-1和CD82外泌體陽性率[9]。

1.6CA19-9測定 依據(jù)河北省人民醫(yī)院檢驗科檢測結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。非正態(tài)分布的計量資料組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用MedCalc v18.2.1統(tǒng)計軟件繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線。相關(guān)分析采用Person相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.12組患者血漿CA19-9和 GPC-1外泌體、CD82外泌體表達比較 PDAC組CA19-9、GPC-1外泌體表達水平高于CP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組CD82外泌體表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組血漿CA19-9、GPC-1外泌體、CD82外泌體表達比較Table 1 Comparison of expression levels of serum CA19-9，GPC-1 exosome and CD82 exosome between two groups [M(QR)]

2.2CA19-9與GPC-1外泌體對PDAC的診斷價值 應(yīng)用MedCalc統(tǒng)計軟件繪制ROC曲線(圖1)，CA19-9診斷PDAC的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.771，95%CI:0.635～0.875，敏感度為70.97%，特異度為72.73%，誤診率為27.27%，漏診率為29.03%。GPC-1外泌體診斷PDAC的AUC為0.918，95%CI：0.809～0.976，敏感度為90.3%，特異度為90.9%，誤診率為9.1%，漏診率為9.7%。GPC-1外泌體對PDAC的診斷價值優(yōu)于CA19-9(Z=2.462，P=0.014)。CA19-9與GPC-1外泌體聯(lián)合診斷PDAC的AUC為0.922，95%CI:0.848～0.997，敏感度為83.9%，特異度為95.5%，誤診率為4.5%，漏診率為16.1%。CA19-9與GPC-1外泌體聯(lián)合診斷PDAC優(yōu)于CA19-9獨立診斷，差異有統(tǒng)計學意義(0.922比0.771，Z=2.745，P=0.006)；CA19-9與GPC-1外泌體聯(lián)合診斷PDAC與GPC-1外泌體獨立診斷差異無統(tǒng)計學意義(0.922比0.918，Z=0.664，P=0.645)。

圖1 血漿CA19-9和GPC-1外泌體及兩指標聯(lián)合的ROC曲線

2.3Person相關(guān)性分析 PDAC患者外周血CA19-9與GPC-1外泌體無相關(guān)(r=0.237，P=0.200)。

3 討 論

有直接證據(jù)表明,GPC-1外泌體可作為早期篩查PDAC的腫瘤生物學標記物[2-3]，然而其臨床應(yīng)用仍需要更多的臨床實踐去檢驗[9-12]，而且臨床上PDAC常需與慢性胰腺炎相鑒別[13]，CA19-9是目前臨床常用的PDAC腫瘤學標記物，但其診斷PDAC的特異度文獻報道最高為70%～80%，而且在路易斯-X抗原陰性的人群不表達[9]，因此本研究希望通過比較GPC-1外泌體、CD82外泌體與CA19-9在兩者鑒別中的作用，進一步提高腫瘤學生物學標記物在PDAC診斷中的價值?；谝酝芯恐校_外泌體在PDAC中的診斷價值主要是實驗方法所導(dǎo)致的外周血中外泌體檢測的不穩(wěn)定性，以及其判定標準的差異[9]。因此，本研究建立了一種基于Python的標準化數(shù)據(jù)處理方法[9]分離及測定外周血中的外泌體，因此所得數(shù)據(jù)真實可靠。CD82外泌體與PDAC分化、侵襲性及預(yù)后密切相關(guān)[7]，與CA19-9作為術(shù)后監(jiān)測PDAC復(fù)發(fā)及預(yù)后指標有同樣的臨床價值。本研究結(jié)果顯示，PDAC患者的外周血中GPC-1外泌體含量明顯高于慢性胰腺炎患者，同時它的檢測效能明顯高于CA19-9(ROC曲線下面積)，這與Xiao等[9]的結(jié)果相一致；PDAC患者外周血中CD82外泌體含量雖然也高于對照組，但是兩組患者間的差異無統(tǒng)計學意義，而且它的檢測效能明顯不如CA19-9(ROC曲線下面積)，這與Xiao等[9]的結(jié)果不一致，可能是對照組的設(shè)定不一樣導(dǎo)致的。本研究將慢性胰腺炎患者設(shè)為對照組，不同于其他關(guān)于外泌體對PDAC的診斷價值的研究將正常人或急性胰腺炎患者設(shè)為對照組[2-3,7,9-12]，而臨床上PDAC常需與慢性胰腺炎相鑒別[1,13-15]，有研究認為慢性胰腺炎是PDAC的癌前病變[16-17]，因此鑒別PDAC與慢性胰腺炎的臨床意義更大，而早期發(fā)現(xiàn)PDAC能顯著改善PDAC的預(yù)后[18]。此外，關(guān)于CD82外泌體的結(jié)果與Xiao等[9]的研究結(jié)果不一致，也有可能與本研究樣本量較小有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示GPC-1外泌體單獨診斷PDAC的AUC為0.918，明顯高于CA19-9(CA19-9單獨診斷PDAC的AUC為0.771)(AUC在0.9以上表示診斷效率較高，而AUC 0.7～0.9表示診斷效率為中等)。而且，GPC-1外泌體單獨診斷PDAC的AUC(0.918)與GPC-1外泌體聯(lián)合CA19-9診斷PDAC的AUC(0.922)無差異。因此GPC-1外泌體對PDAC的診斷價值優(yōu)于CA19-9，并且不劣于GPC-1外泌體聯(lián)合CA19-9的診斷價值。

CA19-9是常用的PDAC相關(guān)血清學腫瘤標志物，但CA19-9不僅在PDAC中異常升高，部分慢性胰腺炎中也異常升高，而且CA19-9 的水平在高膽紅素血癥的條件下可能不夠準確，此外，人群中約10%為路易斯抗原無產(chǎn)物型，不分泌 CA19-9，并且如果排除梗阻性黃疸因素的影響[5,19]，外周血中GPC-1外泌體的測定較CA19-9更具診斷價值，并且外周血中GPC-1外泌體的測定單獨用于診斷PDAC時其診斷效率并不劣于兩指標、三指標聯(lián)合的診斷效率。另外根據(jù)本實驗數(shù)據(jù)所得外周血中GPC-1外泌體的測定用于診斷PDAC的敏感度為90.3%，特異度為90.9%。目前檢測外周血GPC-1外泌體含量的方法較多，想要得到穩(wěn)定的檢驗結(jié)果，其方法復(fù)雜、費用高；其次，目前應(yīng)用于臨床的病例數(shù)量相對較少。因而GPC-1外泌體含量測定能廣泛應(yīng)用于臨床早期診斷PDAC，像甲胎蛋白用于乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝細胞肝癌那樣量化診斷價值，還有很長的路要走[11,20]。

綜上所述，外周血中GPC-1外泌體的測定對PDAC具有很高的診斷價值，優(yōu)于CD82外泌體和CA19-9，GPC-1外泌體聯(lián)合CA19-9可以提高診斷PDAC的特異性，降低誤診率。