周鑫宇 柳東紅 蔡仕良 陳宏森 何奕達(dá) 王瑞華 曹廣文

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2020年原發(fā)性肝癌發(fā)病人數(shù)居所有癌癥第六位，而死亡人數(shù)居所有癌癥第三位；且在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，占 75%～85%［1-2］。在我國，原發(fā)性肝癌位于非成熟死亡（平均壽命之前的死亡）原因第一位，其中HCC占94.6%，且我國的HCC主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染引起（占87.5%）［3-5］。盡管隨著HBV疫苗的普及以及對攜帶者進(jìn)行積極的抗病毒治療，HBV感染所致的HCC造成的負(fù)擔(dān)已逐漸減輕［6-8］，但治療乙型肝炎仍然是我國HCC初級預(yù)防的關(guān)鍵戰(zhàn)略。

HBV致癌依賴三大因素：病毒復(fù)制、整合和進(jìn)化，其中HBV X基因（HBV X gene，HBx）在這個過程中起主要作用。HBx通過促進(jìn)共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA）結(jié)合的組蛋白乙?；筒《鞠拗埔蜃臃核鼗葯C(jī)制促進(jìn)HBV復(fù)制。HBx還是HBV整合到宿主基因組的最主要區(qū)域，并導(dǎo)致有促癌能力的C-端截短型HBx（c-terminal truncated HBx，Ct-HBx）和融合轉(zhuǎn)錄本形成。同時，HBx也是HBV進(jìn)化的主要區(qū)域，免疫微環(huán)境和遺傳選擇下的HBx變異具有更強(qiáng)的致癌能力。此外，HBx及其變異可以調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響相關(guān)信號通路激活，從而發(fā)揮原癌基因作用，進(jìn)而參與HCC發(fā)生發(fā)展中的多種生物學(xué)過程［9］。因此，研究HBx及其變異在HBV相關(guān)HCC（HBV-HCC）發(fā)生發(fā)展以及防治等方面的作用有重要意義。本文就HBx及其變異在HCC中的致癌作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 HBx調(diào)控HBV復(fù)制

HBV是一種部分雙鏈的環(huán)狀DNA病毒，約3.2 kb。HBV病毒具有4個開放閱讀框，分別是S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)以及X區(qū)，編碼7種蛋白質(zhì)（preS1、preS2、S、preC、C、病毒聚合酶、HBx蛋白）和4個調(diào)控元件（增強(qiáng)子Ⅱ/基礎(chǔ)核心啟動子、preS1啟動子、preS2/S啟動子和增強(qiáng)子Ⅰ/X啟動子）。HBx基因全長為779 bp（nt.1060～1838），其中nt.1060～1373段為HBx的啟動子區(qū)，nt.1374～1838為HBx的編碼區(qū)；而HBx的編碼區(qū)是HBV基因組最小的開放閱讀框，編碼154個氨基酸，蛋白大小為17 kDa；因HBx蛋白與目前已知的蛋白均不具有同源性，故而得名［9］。HBx促癌機(jī)制見圖1。

圖1 HBx促癌機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of HBx promoting cancer mechanism

HBV的復(fù)制可導(dǎo)致持續(xù)的慢性炎癥，這也是導(dǎo)致肝硬化和HCC發(fā)生的關(guān)鍵因素，高病毒載量還與不良預(yù)后相關(guān)［10］。在HBV的生命周期中，HBx是HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制的調(diào)控蛋白。HBx通過參與多種表觀遺傳修飾如甲基化、乙?；?、泛素化和非編碼RNA的表達(dá)來影響cccDNA的表達(dá)和HBV復(fù)制［11］。

乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰轉(zhuǎn)移酶通過調(diào)控cccDNA結(jié)合的組蛋白狀態(tài)，對cccDNA發(fā)揮翻譯后修飾功能，從而影響HBV復(fù)制。HBx在促進(jìn)cccDNA結(jié)合的組蛋白乙?；耐瑫r也防止其去乙?；?，從而產(chǎn)生更多的前基因組RNA，并增加HBV循環(huán)［12］。HBx還可使關(guān)鍵分子泛素化，干擾天然免疫反應(yīng)對HBV的攻擊，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸并維持HBV穩(wěn)定復(fù)制。DNA損傷特異性結(jié)合蛋白1（damage-specific DNA binding protein 1，DDB1）是病毒復(fù)制必須的，HBx與DDB1的相互作用還可使HBV限制因子WDR77、SMC5/6和SETDB1等泛素化和降解，從而促進(jìn)cccDNA轉(zhuǎn)錄和HBV復(fù)制［13］。miRNA可以調(diào)控HBV復(fù)制，同時也能被HBV復(fù)制所調(diào)控，其中HBx起主要調(diào)控作用。HBx引起的miR-122下調(diào)還會增強(qiáng)HBV的復(fù)制能力，同時誘導(dǎo)病毒持續(xù)性感染［11］。

2 HBx是HBV整合的高頻區(qū)域

HBV整合到宿主基因組是HCC發(fā)生的分子機(jī)制之一，高通量測序表明，在76.9%的HBV-HCC患者中，HBV基因組會整合到宿主基因中［14］。雖然HBV是隨機(jī)整合到宿主基因組中，但是病毒基因組內(nèi)nt.1600～nt.1900之間的區(qū)域（對應(yīng)HBx區(qū)的3'端和前核心區(qū)的5'端）是發(fā)生整合最常見的區(qū)域［15］。

2.1 Ct-HBx具有更強(qiáng)的促癌能力

HBx區(qū)的3'端整合到宿主基因組導(dǎo)致Ct-HBx產(chǎn)生，且Ct-HBx與不良預(yù)后相關(guān)［16］。目前，各種不同的Ct-HBx已在HBV感染以及相應(yīng)的肝硬化和HCC患者中被發(fā)現(xiàn)。Ct-HBx較全長HBx有更強(qiáng)的促癌作用，其中與HCC發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的Ct-HBx包括HBx-△127、HBx-△130、HBx-△124、HBx-△140、HBx-△119、HBx-△120、HBx-△134等［17］。其中研究最多的是HBx-△127，其可促進(jìn)正常肝細(xì)胞中NF-κB、生存素和人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以及促進(jìn)c-Myc和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)水平，還能通過5-LOX上調(diào)SREBP1c表達(dá)增加FAS的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長［18］。HBx-△120或HBx-△134可與NFATC2協(xié)同作用下調(diào)TXNIP表達(dá)，從而導(dǎo)致糖代謝重編程，進(jìn)而啟動HCC的發(fā)生并促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲［19］。HBx-△130或HBx-△119可以激活 caveolin-1/LRP6/β-catenin/FRMD5軸，從而促進(jìn)HCC發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移［20］。

2.2 HBx導(dǎo)致宿主基因組整合突變

HBV整合到宿主基因組上，從而干擾宿主基因組穩(wěn)定性。HBx整合到TERT、MLL4和FN1等癌癥相關(guān)基因的調(diào)控區(qū)域并影響其表達(dá)［15］。HBV整合容易產(chǎn)生HBV-宿主嵌合轉(zhuǎn)錄本，發(fā)揮致癌作用。HBV-宿主嵌合轉(zhuǎn)錄本主要是HBx基因與人類基因內(nèi)含子內(nèi)重復(fù)元件的融合［21］。HBx-LINE1嵌合轉(zhuǎn)錄本作為一種長鏈非編碼RNA，可下調(diào)miR-122表達(dá)水平，導(dǎo)致WNT/β-catenin通路活性增加，并誘導(dǎo)集落形成以及細(xì)胞侵襲和遷移，最后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展［22］。

3 HBV進(jìn)化產(chǎn)生更強(qiáng)致癌能力的HBx變異

在慢性乙型肝炎進(jìn)展到HCC的過程中，HBV進(jìn)化是最突出的分子事件［23-24］。HBV的進(jìn)化遵循達(dá)爾文模型：突變-選擇-適應(yīng)。在HBV病毒復(fù)制過程中因缺乏校對功能而容易發(fā)生基因突變，而慢性炎癥環(huán)境使突變率增加［23，25］。大多數(shù)HBV突變體被抗病毒免疫反應(yīng)消除，只有小部分利于病毒復(fù)制生存且促進(jìn)肝細(xì)胞再生的突變HBV能夠存活，并逐漸發(fā)展成促HCC克?。?6］。HBx是HBV發(fā)生突變的高頻區(qū)域，在人載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptides，APOBECs）、遺傳易感性、免疫微環(huán)境和抗病毒治療等作用下，HBx變異發(fā)生累積，而具有強(qiáng)烈致癌作用的突變型HBx被選擇，從而可以預(yù)測HCC的發(fā)生與復(fù)發(fā)。

3.1 HBx變異的產(chǎn)生與APOBECs

使HCC發(fā)生風(fēng)險增加的HBV突變主要位于增強(qiáng)子Ⅱ/基礎(chǔ)核心啟動子區(qū)/前核心（EnhⅡ/BCP/PC）以及preS區(qū)域［27］。其中增強(qiáng)子Ⅱ（nt.1636～1744）和基礎(chǔ)核心啟動子區(qū)（nt.1751～1769）與HBx開放閱讀框（nt.1060～1838）重疊。其中，APOBECs誘導(dǎo)的突變是HBV變異的來源［28］。APOBEC3s的表達(dá)水平與HBV準(zhǔn)種復(fù)雜性呈正相關(guān)［29］。衰老、環(huán)境暴露和遺傳易感性有助于激活和維持非溶解性炎癥，活化的炎癥信號通路可以反式激活A(yù)POBECs表達(dá)，從而促進(jìn)HBV和體細(xì)胞突變。IL-6誘導(dǎo)的APOBEC3B-UNG失衡的遺傳多態(tài)性能顯著促進(jìn)HCC-HBV突變的產(chǎn)生［30］。EnhⅡ/BCP/PC區(qū)對APOBEC3成員的編輯非常敏感，編碼HBx的序列尤其容易被編輯。APOBEC3更傾向于將HBx區(qū)域作為其編輯靶點(diǎn)，并產(chǎn)生Ct-HBx等突變型［31］。

3.2 HBx突變在HCC發(fā)生發(fā)展過程中逐漸累積

目前在病例對照研究和隊(duì)列研究中均發(fā)現(xiàn)位于HBx基因區(qū)的幾個關(guān)鍵突變（G1613A、C1653T、T1674C/G、T1753V、A1762T/G1764A）是HCC發(fā)生的風(fēng) 險 指 標(biāo)［32-33］，突 變 組 合（C1653T、T1753V 和A1762T/G1764A）還可有效預(yù)測HCC的發(fā)生［34］。在一項(xiàng)包含43項(xiàng)研究的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，C1653T、T1753V以及A1762T/G1764A雙突變均與HCC發(fā)生風(fēng)險有關(guān)，且這些突變在乙型肝炎感染者從無癥狀攜帶發(fā)展為HCC過程中是逐漸累積的，同時無論是存在單獨(dú)位點(diǎn)還是這些位點(diǎn)的組合突變都具有HCC發(fā)生風(fēng)險［35］。以上流行病學(xué)研究表明，在慢性肝炎所致的肝硬化向HCC進(jìn)展過程中，HBx突變的種類和頻率逐步累積，且HBx突變的累積是HCC發(fā)生的高危因素，HBx突變組合可用于預(yù)測HCC的發(fā)生和發(fā)展。

3.3 HBx突變與遺傳及免疫環(huán)境相互作用

HBx突變的選擇是由遺傳及免疫微環(huán)境共同決定的，與歐洲人群相比，我國人群的常見基因型與HBV慢性感染風(fēng)險增加以及HBx突變的免疫選擇顯著相關(guān)［26］。在我國人群中，STAT3基因的rs2293152少見基因型顯著促進(jìn)HBx突變A1762T/G1764A和T1674C/G的選擇，并且與HBx突變存在顯著的交互作用，協(xié)同促進(jìn)HCC發(fā)生［36］。NF-κB1與其抑制分子NFKBIA啟動子遺傳多態(tài)性是HBV C型感染者發(fā)生HCC的危險因素，NFKBIA啟動子SNP，rs2233406和rs3138053的少見基因型（rs2233406T、rs3138053G）通過降低NFKBIA表達(dá)，增加NF-κB1活性，促進(jìn)炎癥對A1762T/G1764A、T1753V等促癌HBx突變的選擇［37］。rs28362491的變異基因型（缺失型）與HBV C型感染者中A1762T/G1764A頻率增加顯著相關(guān)；rs2233406少見基因型還與A1762T/G1764A交互作用而顯著增加HCC發(fā)生風(fēng)險［37］。HLA-DP的遺傳多態(tài)性（rs3077、rs3135021、rs9277535）與HBV炎癥慢性化密切相關(guān)，促進(jìn) HBV 清 除 的 基 因 型（rs3077T、rs3135021A、rs9277535A）與HBx促癌突變（C1653T、T1674C/G等）呈負(fù)相關(guān)，而與抑癌HBx突變（G1652A、T1673C、T1674C、G1719T、G1730C、G1799C 和A1727T）呈正相關(guān)［38］。我國HLA-DR SNPs少見基因型（rs3135395T、rs3135338C和rs477515T）可顯著降低HBV持續(xù)存在和HCC發(fā)生風(fēng)險，且HLA-DR少見基因型與HBx區(qū)突變（A1762T/G1764A、T1753V和C1653T）的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)［39］。還有研究顯示，HLA-DP、HLA-DR和HLA-DQ的遺傳多態(tài)性均與HBx突變在乙型肝炎導(dǎo)致的HCC中存在顯著的交互作用［40］。

3.4 HBx突變與抗病毒治療藥物

高病毒載量與HBV-HCC患者術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)，抗病毒治療可以顯著降低HCC復(fù)發(fā)及其相關(guān)死亡風(fēng)險［41-42］，但對Ct-HBx的促癌能力沒有影響［43］。長期治療期間，核苷類似物的療效會因耐藥突變體的出現(xiàn)而降低。研究發(fā)現(xiàn)在耐藥患者中HBx的L30V、P31S、L34F、P39S、A40P、P42S、P43S、T47A、G87Q/R、N88V、T118K、E119D、V127I、K130M、V131I等15個氨基酸殘基出現(xiàn)了較高的突變頻率，還存在多個位點(diǎn)的缺失/截?cái)嗪筒迦耄疫@些耐藥患者中的HBx突變通過增加核cccDNA水平補(bǔ)償核苷類似物對HBV復(fù)制的抑制作用［44］。

3.5 HBx突變影響HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制

HBx基因區(qū)的堿基突變可引起對應(yīng)的氨基酸改變，影響HBx蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而增強(qiáng)HBx的致癌潛能和HBV復(fù)制和免疫逃逸能力。A1762T和G1764A突變導(dǎo)致的HBx蛋白K130M和V131I突變是最常見的HBx突變類型，這兩個突變常常一起出現(xiàn)，該類型突變可影響細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和HCC的發(fā)生［45］。K130M/V131I突變，尤其是A1762T/G1764A/T1753A/T1768A組合突變（I127N/K130M/V131I/F132Y）可通過激活E2F1轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)SKP2的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期抑制相關(guān)蛋白（p21、p53等）泛素化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［46］。在動物模型中K130M/V131I突變可通過激活A(yù)KT/FOXO1通路和影響花生四烯酸代謝誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展［47］。野生型HBV可以激活HIF-1α而促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展，而K130M/V131I突變可以進(jìn)一步上調(diào)HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性［48］。K130M、V131I、K130M/V131I尤其是I127N/K130M/V131I/F132Y對細(xì)胞的遷移、增殖能力和Wnt/β-catenin信號通路的激活作用較野生型強(qiáng)［49］。

4 HBx影響信號通路和基因表達(dá)而直接致癌

HBx除了在HBV的復(fù)制、整合和進(jìn)化中起關(guān)鍵作用，同時也作為一種重要的癌蛋白，參與多種HCC相關(guān)信號通路，影響關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、耐藥及誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和癌細(xì)胞干性，擾亂細(xì)胞代謝、影響DNA損傷修復(fù)等，發(fā)揮直接致癌作用［9］。

4.1 HBx參與的HCC信號通路

HBx在HCC發(fā)生發(fā)展過程中參與多條信號通路，其中備受關(guān)注的信號通路包括MAPK信號通路、NF-κB信號通路、Notch信號通路以及Wnt/β-catenin信號通路。HBx激活JNK信號通路，使PXN 178位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，從而促進(jìn)HCC侵襲并導(dǎo)致不良預(yù)后［50］。lncRNA IHS同時受HBx和SMYD3調(diào)控，通過MEK/ERK信號通路促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移、侵襲和增殖［51］。HBx也能通過抑制miR-34a促進(jìn)IKKβ誘導(dǎo)的NF-κB活化，以及誘導(dǎo)STAT3磷酸化，共同促進(jìn)HMGB1表達(dá)和分泌，從而促進(jìn)HCC的EMT進(jìn)展和血管生成［52］。HBx還可通過激活HCC中的NF-κB信號通路上調(diào)CEBP/α，進(jìn)而促進(jìn)IL-34表達(dá)，最終導(dǎo)致HCC細(xì)胞增殖和遷移［53］。ZHX2與NF-YA相互作用能抑制Notch1轉(zhuǎn)錄，而HBx與轉(zhuǎn)錄因子CREB相互作用可促進(jìn)miR-3188轉(zhuǎn)錄，下調(diào)ZHX2，降低ZHX2對Notch信號通路的抑制作用，從而誘導(dǎo)HCC的發(fā)生［54］。HBx還能下調(diào)PTEN而增強(qiáng)β-catenin/c-Myc信號通路，激活B7-H1的轉(zhuǎn)錄活性，增加PD-L1表達(dá)，抑制T細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)HBV免疫逃逸［55］。HBx誘導(dǎo)的miR-5188也能損害FOXO1，從而刺激β-catenin核易位，激活Wnt信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞形成［56］。

4.2 HBx對基因表達(dá)的調(diào)控作用

4.2.1 HBx與轉(zhuǎn)錄因子相互作用 HBx蛋白是一種反式激活因子，但HBx本身不能直接與DNA結(jié)合，其轉(zhuǎn)錄活性是通過與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活各種病毒和細(xì)胞的啟動子和增強(qiáng)子，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生發(fā)展。如HBx與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子SP1協(xié)同作用，上調(diào)SWELL1［57］。HBx還可通過轉(zhuǎn)錄因子c-Jun激活LASP-1啟動子活性，促進(jìn)其表達(dá)［58］。

4.2.2 HBx與表觀遺傳修飾 表觀遺傳變化可影響編碼和非編碼基因的表達(dá)，促進(jìn)HBV復(fù)制和HCC的發(fā)生發(fā)展。表觀遺傳改變可由多種因素引起，如病原體、化學(xué)物質(zhì)、紫外線等。在HBV-HCC中，HBx被認(rèn)為是影響表觀遺傳最重要的因素之一。HBx通過調(diào)節(jié)基因啟動子的甲基化狀態(tài)來調(diào)節(jié)下游分子表達(dá)。一方面，HBx上調(diào)DNMT3A表達(dá)并與DNMT3A相互作用，使PTPN13啟動子區(qū)DNA甲基化水平升高，從而抑制PTPN13的轉(zhuǎn)錄［59］。另一方面，HBx可誘導(dǎo)RelA與EZH2、TET2和DNMT3L形成復(fù)合物，導(dǎo)致EpCAM的NF-κb側(cè)CpG位點(diǎn)去甲基化，從而上調(diào)EpCAM表達(dá)［60］。HBx與MBD2以及CBP/p300相互作用可誘導(dǎo)MBD2-HBx-CBP/p300復(fù)合物形成，介導(dǎo)組蛋白H3和H4的乙酰化［61］。ZHX2是HCC相關(guān)腫瘤抑制基因，而HBx可促進(jìn) miR-155表達(dá)［62］，進(jìn)而降低ZHX2水平。DLEU2是一種lncRNA，HBx可增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)其在感染肝細(xì)胞中積累，HBx與DLEU2以及EZH2結(jié)合，可解除EZH2對其靶基因的抑制作用，促進(jìn)病毒復(fù)制以及下游宿主基因的轉(zhuǎn)錄激活［63］。HBx與SKP2結(jié)合也可導(dǎo)致SHIP2泛素化，促進(jìn)HCC進(jìn)展［64］。

5 小結(jié)與展望

HBx基因與其編碼的蛋白通過促進(jìn)HBV復(fù)制、整合到宿主基因組和發(fā)生變異，并調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)和信號通路的激活，廣泛參與到慢性肝炎-肝硬化-肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，在HBV-HCC發(fā)生、復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃逸中起重要作用。目前，HBx對HBV復(fù)制、基因表達(dá)調(diào)控等方面已經(jīng)得到廣泛的研究，流行病學(xué)證據(jù)表明突變型HBx與HBV-HCC的關(guān)系密切。突變型HBx具有比野生型HBx更強(qiáng)的致癌能力且與抗病毒治療耐藥相關(guān)，但突變型HBx在HBV-HCC發(fā)生發(fā)展以及耐藥過程中的具體作用機(jī)制研究仍較少。今后進(jìn)一步深入研究HBx及其突變的致癌機(jī)制及研發(fā)靶向HBx突變的藥物，對HBV-HCC的預(yù)防、治療和預(yù)后預(yù)測有重要意義。