秦小玲 劉順 龐婷 劉美良 伍柳玉 曾小云，3

原發(fā)性肝癌作為全球第六大常見(jiàn)癌癥和第三大癌癥死亡原因，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命與健康［1］。其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌的75%以上。然而，HCC早期癥狀不明顯、發(fā)病隱匿，且目前尚缺乏可靠的早期診斷指標(biāo)，因此大部分患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后往往較差。DNA甲基化作為腫瘤早期診斷生物標(biāo)志物得到普遍認(rèn)可［2］。就HCC而言，多個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)聯(lián)合診斷HCC具有很大優(yōu)勢(shì)，在診斷HCC中靈敏度和特異度均較高［3-4］。然而，這些診斷標(biāo)志物并未展現(xiàn)出對(duì)HCC早期診斷的優(yōu)勢(shì)，因此挖掘HCC早期診斷生物標(biāo)志物仍是亟需研究的方向和目標(biāo)。本研究綜合分析來(lái)自癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC的DNA甲基化和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并篩選出可有效診斷HCC的候選甲基化CpG位點(diǎn)，然后在BCLC-A期HCC樣本及GEO數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得一組有希望成為HCC早期診斷生物標(biāo)志物的CpG位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)資料

基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cancergenome.nih.gov/）獲取原發(fā)性肝癌相關(guān)的DNA甲基化、mRNA表達(dá)譜以及臨床數(shù)據(jù)，其中DNA甲基化數(shù)據(jù)從Illumina Human-Methylation 450K平臺(tái)檢測(cè)獲得。排除術(shù)前接受治療（放療或化療等）和（或）伴其他腫瘤患者的樣本，最終納入種族信息明確的原發(fā)性HCC樣本299例（其中40例匹配有癌旁組織樣本信息）。

1.2 篩選候選甲基化CpG位點(diǎn)

1.2.1 甲基化CpG位點(diǎn)的差異分析 使用R語(yǔ)言（3.5.0版）中的“ChAMP”軟件包［5］識(shí)別HCC組織和癌旁組織的差異甲基化CpG位點(diǎn)。Δβ值指癌組織和癌旁組織β均值之差。本研究將調(diào)整后P＜1×10-10和|Δβ|＞0.2設(shè)定為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 基因mRNA表達(dá)差異分析 在R/Bioconductor環(huán)境下，使用“DESeq”軟件包［6］進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。將P＜0.05且|log2FC|＞1作為差異表達(dá)基因的篩選閾值。

1.2.3 HCC診斷相關(guān)候選甲基化CpG位點(diǎn)的鑒定將差異甲基化的CpG位點(diǎn)與差異表達(dá)基因進(jìn)行匹配，利用Venny 2.1軟件繪制韋恩圖，篩選出甲基化水平與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的CpG位點(diǎn)?；赗語(yǔ)言采用“PAMR”軟件包和10折交叉驗(yàn)證進(jìn)行微陣列預(yù)測(cè)分析（prediction analysis of microarrays，PAM）［7］，獲得的CpG位點(diǎn)集進(jìn)行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，將曲線下面積（area under curve，AUC）＞0.900的CpG位點(diǎn)中的5個(gè)進(jìn)行隨機(jī)組合，然后結(jié)合logistic回歸和ROC曲線進(jìn)行聯(lián)合診斷，獲得聯(lián)合診斷AUC最大的候選位點(diǎn)。

1.3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證候選CpG位點(diǎn)在HCC組織的特異性

為了分析候選CpG位點(diǎn)甲基化水平上調(diào)是否具有HCC組織特異性，本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取14種常見(jiàn)癌癥的DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，依次為膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）、乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）和膽管細(xì)胞癌（cholangiocarcinoma，CHOL）。

1.4 焦磷酸測(cè)序和qRT-PCR檢測(cè)候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平及所在基因的表達(dá)水平

1.4.1 一般資料 收集2016年4月至2018年5月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰脾外科手術(shù)切除的50例BCLC-A期HCC患者作為研究對(duì)象，平均年齡為（53.38±13.09）歲（范圍：16～84歲）；男性42例，女性8例；漢族32例，壯族18例。同時(shí)收集其手術(shù)切除的HCC組織及相應(yīng)癌旁組織（距離病灶＞2 cm）樣本。通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查、查閱病歷獲取研究對(duì)象的一般情況、既往病史、家族史以及臨床病理資料等。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，自愿加入本研究。

1.4.2 焦磷酸測(cè)序檢測(cè) 按照Thermo Scientific Gene-JET基因組DNA純化試劑盒（Thermo Scientific，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)提取組織樣本總DNA，用Bio-Tek酶標(biāo)儀檢測(cè)DNA濃度和純度，要求濃度值＞50 ng/μL，且吸光度OD260/280=1.7～2.0，OD260/230≥1.4。 然 后 采 用 EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit 59124（Qiagen，德國(guó)）對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。候選CpG位點(diǎn)cg12614630（GPR182）、cg19786751（ACACB）、cg06131338（ACACB）和cg23371746（TBX15）的甲基化特異性引物序列均由華大基因設(shè)計(jì)合成（因cg25340966未成功設(shè)計(jì)引物，未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)），見(jiàn)表1。按照KAPA2G Robust HotStart DNA Polymerase with dNTPs（250 U）-KK5516（KAPA Biosystems，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，采用ABI 9700 PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后在PyroMark Q96 ID平臺(tái)（Qiagen，德國(guó)）進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，用Pyro Q-CpG軟件（Qiagen，德國(guó)）自動(dòng)分析獲得候選位點(diǎn)的甲基化率。

表1 4個(gè)候選CpG位點(diǎn)的引物序列Tab.1 Primers sequences of 4 candidate CpG sites

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè) 使用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）和PrimeScriptTMRT試劑盒（Takara，中國(guó)）進(jìn)行總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表2。按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)在PCR儀（StepOnePlus，ABI公司，美國(guó)）上對(duì)目的基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序設(shè)置：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-△△Ct公式計(jì)算。

表2 目的基因的引物序列Tab.2 Primers sequences of target genes

1.5 GEO數(shù)據(jù)集驗(yàn)證候選CpG位點(diǎn)的診斷效能

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載 3個(gè)甲基化數(shù)據(jù)集（GSE54503［8］、GSE89852［9］和GSE56588［10］）作為驗(yàn)證集，其甲基化數(shù)據(jù)均由Illumina HumanMethylation 450K平臺(tái)檢測(cè)。GSE54503包含66對(duì)HCC樣本；GSE89852包含37對(duì)肝炎病毒相關(guān)HCC樣本；GSE56588包含244例HCC、10例正常肝組織和9例肝硬化樣本。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 3.5.0軟件對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析并篩選候選CpG位點(diǎn)。基于SPSS 20.0軟件進(jìn)行診斷效能驗(yàn)證，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較50例早期HCC樣本不同特征分組間的甲基化水平，配對(duì)t檢驗(yàn)比較經(jīng)配對(duì)的HCC組織與癌旁組織間甲基化水平和基因表達(dá)水平；Spearman秩相關(guān)分析候選位點(diǎn)甲基化與基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性。采用ROC曲線分析評(píng)估候選CpG位點(diǎn)對(duì)早期HCC及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC樣本的診斷效能，確定最終診斷生物標(biāo)志物。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 候選CpG位點(diǎn)的篩選結(jié)果

下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中299例HCC和40例癌旁組織樣本，基本臨床信息見(jiàn)表3。經(jīng)差異甲基化分析鑒定了30 439個(gè)差異甲基化CpG位點(diǎn)，包括10 572個(gè)上調(diào)和19 867個(gè)下調(diào)的CpG位點(diǎn)，見(jiàn)圖1A。基因差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，HCC組織中有1 021個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，2 098個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。通過(guò)在線軟件Venny 2.1篩選了1 611個(gè)甲基化水平與相應(yīng)基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的CpG位點(diǎn)，見(jiàn)圖1B。當(dāng)PAM分析設(shè)置誤判率為最小值（0.027）時(shí)，識(shí)別出86個(gè)CpG位點(diǎn)。ROC曲線分析評(píng)估86個(gè)CpG位點(diǎn)的診斷效能，其中10個(gè)CpG位點(diǎn)顯示出較高的區(qū)分HCC與正常肝組織的效能（AUC＞0.900），見(jiàn)表4。10個(gè)CpG位點(diǎn)所在的基因均在HCC組織中表達(dá)下調(diào)，其中TBX15、ACACB、FAHD2A、GPR182、TACSTD2表達(dá)水平下降更明顯，見(jiàn)圖1C。將上述10個(gè)CpG位點(diǎn)中的5個(gè)進(jìn)行隨機(jī)組合后進(jìn)行多變量聯(lián)合診斷的ROC曲線分析，最終獲得AUC最佳（0.993）的一組CpG位點(diǎn)（包括cg12614630、cg19786751、cg06131338、cg23371746 和 cg25340966）作為候選診斷生物標(biāo)志物，見(jiàn)圖2。

表3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC樣本的基本臨床信息［n（%）］Tab.3 Clinical information of HCC samples from TCGA database［n(%)］

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC甲基化差異分析和基因表達(dá)差異分析Fig.1 Analysis of differential methylation and differential gene expression of HCC from TCGA database

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中5個(gè)候選CpG位點(diǎn)的ROC曲線分析Fig.2 ROC curve analysis of 5 candidate CpG sites based on TCGA database

表4 10個(gè)候選CpG位點(diǎn)的ROC曲線分析Tab.4 The ROC curve analysis of 10 candidate CpG sites

2.2 5個(gè)候選CpG位點(diǎn)在HCC組織中的特異性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證5個(gè)候選CpG位點(diǎn)在HCC組織中高甲基化的組織特異性，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，5個(gè)候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平僅在膽管細(xì)胞癌組織中高于癌旁組織（P＜0.05），在其余13種癌癥的癌組織中均未見(jiàn)5個(gè)候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平明顯上調(diào)，見(jiàn)表5。

表5 5個(gè)候選CpG位點(diǎn)在14種癌癥中的甲基化水平Tab.5 Methylation levels of 5 candidate CpG sites in 14 cancers

2.3 候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平及其與所在基因表達(dá)水平的相關(guān)性

采用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)50例BCLC-A期HCC患者中4個(gè)候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平，結(jié)果顯示，在性別、年齡、AFP和乙型肝炎病毒感染等特征中，4個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平均衡可比，但僅發(fā)現(xiàn)早期HCC組織中單發(fā)腫瘤的cg23371746位點(diǎn)甲基化水平高于多發(fā)腫瘤（P=0.028），見(jiàn)表6。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，這4個(gè)CpG位點(diǎn)在早期HCC組織中的甲基化水平升高（P＜0.001），見(jiàn)圖 A～D；GPR182和ACACB基因在早期HCC組織中低表達(dá)（P＜0.001），而TBX15基因在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.410），見(jiàn)圖3E～G。

表6 50例BCLC-A期HCC患者中4個(gè)候選CpGs位點(diǎn)基于不同特征的甲基化率比較Tab.6 Comparison of different signature-based methylation levels of 4 candidate CpG sites in 50 BCLC-A stage HCC patients

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，cg12614630位點(diǎn)的甲基化水平與GPR182基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.427，P＜0.001）；cg19786751位點(diǎn)（rs=-0.401，P＜0.001）和 cg06131338位點(diǎn)（rs=-0.210，P=0.036）的甲基化水平與ACACB基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；而cg23371746位點(diǎn)甲基化水平與TBX15基因表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（rs=-0.027，P=0.792），見(jiàn)圖3H～K。

圖3 4個(gè)候選CpG位點(diǎn)的甲基化水平差異分析及與所在基因的相關(guān)分析Fig.3 Differential analysis of methylation levels of 4 candidate CpG sites and correlation analysis with corresponding genes

2.4 3個(gè)候選CpG位點(diǎn)在早期HCC及公共數(shù)據(jù)集中的診斷效能

進(jìn)一步對(duì)以上采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析呈負(fù)相關(guān)的3個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，cg12614630、cg19786751和cg06131338的AUC分別為 0.804、0.850、0.709（均P＜0.001）；將這3個(gè) CpG位點(diǎn)作為診斷生物標(biāo)志物，其聯(lián)合診斷的AUC為0.903（P＜0.001），見(jiàn)圖4A。其logistic回歸方程為logit（P）=-15.715+5.607×cg12614630+24.586×cg19786751-8.217×cg06131338。

基于上述的logistic回歸方程，進(jìn)一步通過(guò)GSE54503、GSE89852和GSE56588這3個(gè)GEO數(shù)據(jù)集驗(yàn)證以上3個(gè)候選CpG位點(diǎn)對(duì)HCC樣本和正常組織樣本的區(qū)分能力，結(jié)果顯示，聯(lián)合cg12614630、cg19786751和cg06131338在3個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中獲得的AUC分別為0.812、0.844和0.934（均P＜0.001），見(jiàn)圖4B。

圖4 早期HCC和GEO數(shù)據(jù)集中3個(gè)CpG位點(diǎn)的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of 3 CpG sites in the early-stage HCC and GEO datasets

3 討論

目前大多數(shù)HCC患者尚難以早期發(fā)現(xiàn)或確診，既往研究顯示早期診斷的HCC患者5年生存率一般＞70%，晚期患者則降至10%左右［11-12］，由此可見(jiàn)早期診斷對(duì)提高患者生存率具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，初步篩選了5個(gè)對(duì)HCC有診斷能力的甲基化CpG位點(diǎn)，且在14種常見(jiàn)癌癥中僅膽管細(xì)胞癌顯示上述5個(gè)候選CpG位點(diǎn)均出現(xiàn)高甲基化，說(shuō)明這5個(gè)候選CpG位點(diǎn)的高甲基化在原發(fā)性肝癌中具有組織特異性。進(jìn)一步以臨床收集的50例早期HCC和3個(gè)GEO公共數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證集，通過(guò)ROC曲線分析最終確定3個(gè)CpG位點(diǎn)（cg12614630、cg19786751和cg06131338）作為診斷生物標(biāo)志物，相關(guān)分析也顯示這3個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平與所在基因（GPR182和ACACB）的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明以上3個(gè)候選位點(diǎn)及所在基因可能是潛在的早期診斷指標(biāo)，且這些位點(diǎn)的高甲基化可能通過(guò)影響其所在基因的表達(dá)而發(fā)揮作用，具體機(jī)制值得深入探索。

近年來(lái)，聯(lián)合多個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)作為肝癌診斷策略越來(lái)越受關(guān)注，但是目前尚沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的組合可用于臨床，此外各研究者基于不同數(shù)據(jù)、分析方法或篩選標(biāo)準(zhǔn)，所獲得的CpG位點(diǎn)組合也完全不同。例如，HLADY等［13］利用cfDNA的全基因組甲基化數(shù)據(jù)篩選出可以區(qū)分肝癌和正常樣本的CpG位點(diǎn)作為聯(lián)合診斷的生物標(biāo)志物。CHENG等［4］則將來(lái)自TCGA的肝癌數(shù)據(jù)和GSE69270數(shù)據(jù)集（健康個(gè)體）結(jié)合分析，從而獲得6個(gè)HCC特異性CpG位點(diǎn)。本研究使用的數(shù)據(jù)不僅包括TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)等公共數(shù)據(jù)，還包括實(shí)驗(yàn)獲得的BCLC-A期HCC的甲基化和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，是基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)及臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證的一組CpG位點(diǎn)（cg12614630、cg19786751和cg06131338），診斷效能較高，說(shuō)明這一組合具有較高的可靠性及良好的診斷效能。

本研究還發(fā)現(xiàn)，3個(gè)候選CpG位點(diǎn)所在的基因GPR182和ACACB也可能是早期HCC潛在的診斷指標(biāo)。一般而言，異常DNA甲基化在腫瘤的早期階段即可發(fā)生，且隨著腫瘤進(jìn)展其甲基化程度可能增加。而目前認(rèn)為，基因表達(dá)調(diào)控是DNA甲基化可能的致癌機(jī)制。既往研究顯示，ACACB基因與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14-15］，且ACACB表達(dá)下調(diào)可能與DNA甲基化異常有關(guān)［16］。而關(guān)于GPR182，目前其與HCC的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道，但近期也有研究報(bào)道GPR182可作為HCC預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物［17］。結(jié)合本研究中cg12614630、cg19786751和cg06131338的甲基化水平與GPR182和ACACB基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)ACACB和GPR182表達(dá)下調(diào)可能受這3個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平調(diào)控，并在HCC癌變中起重要作用，但具體的致癌機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，cg12614630、cg19786751和cg06131338 CpG位點(diǎn)可能是HCC潛在的診斷生物標(biāo)志物，3者聯(lián)合診斷在HCC中具有較高的準(zhǔn)確性，可能是HCC早期診斷的有效檢測(cè)策略。但是本研究的對(duì)比樣本均為同一患者的HCC組織與癌旁組織，尚未獲取正常對(duì)照者肝臟組織做對(duì)比，此外本組CpG位點(diǎn)的潛在臨床價(jià)值也還需在血液、細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。