林懋捷 易峰濤，2

正常情況下，惡性腫瘤的生長(zhǎng)都依賴于血管的生成，包括新生血管的生成以及將現(xiàn)有的血管重新聚集到不斷增大的腫瘤組織中［1］。多數(shù)肝臟腫瘤具有血供豐富的特點(diǎn)，血管因素在肝臟腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤和轉(zhuǎn)移過程起著至關(guān)重要的作用［1-3］。臨床上多數(shù)肝癌患者因確診時(shí)已處于中晚期而失去手術(shù)機(jī)會(huì)。氬氦刀凍融治療是一種局部物理治療手段，對(duì)不宜手術(shù)切除的肝臟惡性腫瘤具有重要治療價(jià)值，與其他消融技術(shù)相比，具有疼痛輕、術(shù)中可監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)［4］。因此，探討凍融治療對(duì)肝臟微血管的影響具有重要意義。320排CT可通過器官灌注和功能成像，明確治療后腫瘤周圍血管的變化，為腫瘤預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。既往研究顯示，腫瘤內(nèi)的微血管密度（microvascular density，MVD）是影響肝癌患者總體生存的因素［5］，能從病理學(xué)層面預(yù)測(cè)患者預(yù)后。本研究擬通過建立兔VX2肝移植瘤模型，采用320排CT灌注成像和免疫組化MVD計(jì)數(shù)法探討氬氦刀凍融治療對(duì)肝臟腫瘤微血管的影響，以期明確氬氦刀凍融治療在臨床上治療肝癌的療效。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑

20只健康日本雄性大白兔來自武漢大學(xué)細(xì)胞儲(chǔ)藏中心，兔齡 5～8個(gè)月，體質(zhì)量為 3～5 kg。3只種植VX2腫瘤細(xì)胞（兔間變表皮鱗癌瘤株）雄性荷瘤兔來自武漢大學(xué)細(xì)胞儲(chǔ)藏中心，兔齡為4～6個(gè)月，體質(zhì)量為2.5～4.0 kg。實(shí)驗(yàn)用兔均經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，用速眠新Ⅱ注射液麻醉，劑量0.1 mL/kg，雙側(cè)后肢肌肉注射，5 min后觀察，若達(dá)到麻醉效果（昏睡狀態(tài)，對(duì)手術(shù)刺激無明顯反映）則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

速眠新Ⅱ注射液購自長(zhǎng)春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獸醫(yī)研究所；注射用頭孢唑林鈉購自齊魯制藥有限公司；碘必樂購自上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司；鼠抗兔血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）抗體、鼠抗兔血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體均購自蘇州百遠(yuǎn)生物科技有限公司；山羊抗兔二抗購自Proteintech公司；PBS磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鈉緩沖液、正常羊血清工作液、鏈霉素卵白素工作液、DAB染色液、蘇木素染液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 兔VX2肝移植瘤模型的構(gòu)建

3只VX2荷瘤兔麻醉后，切取有光澤白色魚肉樣且生長(zhǎng)良好的腫瘤組織，放入含適量小牛血清的生理鹽水中，剪成直徑≤1 mm小塊，備用。20只健康雄性大白兔麻醉后，固定、剃毛、剖腹、暴露肝臟。用眼科無齒鑷將腫瘤組織分別植入2個(gè)肝葉，用無菌明膠海綿填塞植入孔，然后縫合腹腔。后肢肌肉注射0.5 g頭孢唑林鈉預(yù)防感染。肝內(nèi)移植VX2細(xì)胞第3周，用超聲檢測(cè)20只大白兔肝內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況，若見生長(zhǎng)于肝內(nèi)的瘤樣結(jié)節(jié)則視為種植成功。

1.3 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)步驟

15只VX2肝移植兔按隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組（凍融0 d）和不同時(shí)間氬氦刀凍融治療組（包括3 d組、7 d組、15 d組、30 d組），每組3只。320排CT增強(qiáng)掃描后，對(duì)照組當(dāng)天經(jīng)耳緣靜脈注射15～20 mL空氣處死；凍融治療組進(jìn)行氬氦刀凍融治療，并分別于治療后第3、7、15、30天再次進(jìn)行320排CT增強(qiáng)掃描，掃描后以同樣方法處死大白兔。然后剖腹、取出肝臟，留取腫瘤組織行病理切片及HE和SP免疫組化染色。

1.3.1 氬氦刀凍融治療方法 各凍融治療組大白兔麻醉后，固定四肢，取仰臥位；腹部剔毛，消毒，放置無菌洞巾，切開皮膚，剝離腫瘤部位皮膚，暴露腫瘤，記錄腫瘤數(shù)量、大小及形態(tài)。將2 mm冷刀從腫瘤中間插入，穿過腫瘤約0.2 cm；插入到位后，接通常溫高壓氬氣進(jìn)行冷凍治療，刀尖溫度在30 s內(nèi)降至-135℃左右，持續(xù)5～10 min后，停止氬氣輸注；改輸常溫高壓氦氣，刀尖溫度在3 min內(nèi)上升到15℃，可見冰球融化。再冷凍-復(fù)溫循環(huán)1次。然后拔除超導(dǎo)刀，填塞明膠海綿止血，消毒、縫合皮膚。

1.3.2 320排CT增強(qiáng)掃描觀察腫瘤及微血管變化 采用東芝320排CT（Aquilion One）進(jìn)行掃描。掃描方法：VX2肝移植兔麻醉后仰臥于掃描床后進(jìn)行動(dòng)態(tài)容積采集，共采集13個(gè)容積。掃描參數(shù)：電壓100 kV，電流100 mA，層距0.5 mm。經(jīng)兔耳靜脈高壓注射碘必樂（370 mg/100 mL），流率1 mL/s，總量1 mL/kg。全程掃描時(shí)間為30 s。掃描完成后將數(shù)據(jù)傳輸?shù)絍ITREA fx Viion 3.0工作站進(jìn)行圖像后處理，應(yīng)用容積再現(xiàn)（volume rendering，VR）和多平面重建（multiplanar reformation，MPR）等后處理技術(shù)觀察腫瘤形態(tài)及血供情況等。

1.3.3 組織學(xué)HE染色法觀察腫瘤組織病理學(xué)的變化 將處死大白兔后留取的部分腫瘤組織置于40%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm組織石蠟切片后進(jìn)行HE染色。石蠟切片經(jīng)梯度脫蠟、水化后用蘇木素染液染色10 min，自來水沖洗，當(dāng)標(biāo)本轉(zhuǎn)為深藍(lán)色后浸入1%稀鹽酸酒精中分色15 s，立即用自來水浸洗15 min，蒸餾水洗3 s，伊紅染色5 min，蒸餾水洗去浮色后常規(guī)脫水、透明、封片。在生物顯微鏡下觀察氬氦刀治療前后腫瘤組織的病理學(xué)改變情況。

1.3.4 免疫組化法觀察微血管的變化 處死大白兔后留取的部分腫瘤組織樣本行SP免疫組化染色。制成4 μm切片后常規(guī)脫蠟脫水；用3% H2O2溶液在37℃下孵育10 min，PBS沖洗后，置于0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液煮沸以修復(fù)抗原（95℃，15 min），冷卻至室溫，用PBS沖洗；然后用正常羊血清工作液封閉，滴加稀釋（1∶1 000）一抗CD31抗體或VEGF抗體（使用PBS緩沖液代替一抗行陰性對(duì)照），4℃孵育過夜，用PBS沖洗；加入二抗，37℃下孵育30 min，PBS沖洗后，滴加鏈霉素卵白素工作液，繼續(xù)孵育30 min，用PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。通過計(jì)數(shù)光鏡下單位面積中微血管數(shù)目（即MVD）量化分析微血管變化。MVD判定標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)［6］的計(jì)數(shù)方法，即首先在低倍光鏡下（×40）選取微血管最密集區(qū)（即“熱點(diǎn)”），然后于高倍光鏡視野下（×200）計(jì)數(shù)“熱點(diǎn)”區(qū)域中4個(gè)視野內(nèi)染成棕黃色的血管數(shù)目并取其平均數(shù)，以表示MVD-CD31或MVD-VEGF的表達(dá)水平。被抗體染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，無論是否形成管腔，只要與周圍微血管、腫瘤細(xì)胞和其他連接組織有清楚界限，則判定為一個(gè)可計(jì)數(shù)的微血管。排除腫瘤內(nèi)硬化區(qū)及腫瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管，以及有平滑肌及管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用不同方法測(cè)量所得的腫瘤大小的一致性采用MedCalc 20.0軟件進(jìn)行Bland-Altman分析；MVD計(jì)數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用GraphPad Prism 8.0.2軟件繪圖。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔VX2肝移植瘤模型鑒定

20只大白兔肝內(nèi)移植VX2細(xì)胞后第3周行超聲檢測(cè)，結(jié)果顯示，5只大白兔未見肝內(nèi)瘤樣結(jié)節(jié)，即建模失?。?5只大白兔肝內(nèi)可見明顯的瘤樣結(jié)節(jié)，視為成功構(gòu)建兔VX2肝移植瘤模型。

2.2 CT增強(qiáng)掃描和剖腹觀察方法測(cè)量兔VX2肝移植瘤

15只成功構(gòu)建的兔VX2肝移植瘤模型經(jīng)CT增強(qiáng)掃描共發(fā)現(xiàn)31個(gè)腫瘤，最大徑為（1.9±1.4）cm。計(jì)數(shù)對(duì)照組解剖時(shí)及凍融治療組行肝內(nèi)腫瘤氬氦刀凍融治療時(shí)的肝內(nèi)腫瘤數(shù)目，共發(fā)現(xiàn)30個(gè)腫瘤，最大徑為（2.0±1.5）cm。上述兩種方法統(tǒng)計(jì)的腫瘤數(shù)目符合率為96.7%；MedCalc 20.0軟件Bland-Altman分析顯示，兩種方法所測(cè)的腫瘤大小最大差值為0.7 cm，均值相差0.02 cm；絕大多數(shù)差值在95%可信區(qū)間以內(nèi)，見圖1。說明兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

圖1 不同方法測(cè)量腫瘤大小的Bland-Altman分析Fig.1 Bland-Altman analysis of tumor size measured by different methods

2.3 氬氦刀凍融治療前后的CT增強(qiáng)掃描結(jié)果

CT增強(qiáng)掃描結(jié)果顯示，對(duì)照組中最大徑在0.5 cm以下的肝內(nèi)VX2移植瘤呈結(jié)節(jié)狀，最大徑在0.5 cm以上的肝內(nèi)VX2移植瘤中間出現(xiàn)壞死，呈囊狀；表現(xiàn)為結(jié)節(jié)實(shí)性部分動(dòng)脈早期即出現(xiàn)明顯強(qiáng)化，靜脈期呈低密度表現(xiàn)；結(jié)節(jié)中壞死部分呈低密度、始終無強(qiáng)化表現(xiàn)，見圖2A。凍融3 d組和7 d組治療區(qū)內(nèi)呈囊變、壞死改變，表現(xiàn)為平掃呈低密度、增強(qiáng)始終無強(qiáng)化改變；三維重建可見治療區(qū)為一空洞。凍融15 d組和30 d組提示壞死范圍縮小，治療區(qū)周邊無明顯強(qiáng)化；結(jié)節(jié)較大時(shí)仍可見囊性、壞死表現(xiàn)。當(dāng)冷凍范圍大于腫瘤邊緣時(shí)周圍未見腫瘤血管殘存；當(dāng)冷凍范圍僅覆蓋甚至小于腫瘤邊緣時(shí)提示明顯腫瘤血管殘存。見圖2B～C。

圖2 凍融治療前后的CT增強(qiáng)掃描結(jié)果Fig.2 CT enhanced scan results before and after cryoablation

2.4 凍融治療前后腫瘤大體標(biāo)本和組織病理學(xué)改變情況

對(duì)照組見腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，光滑無包膜，腫瘤最大徑在0.5 cm以上的，中間可見壞死，呈乳白色渣樣物質(zhì)；HE染色示腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布，排列紊亂，與周圍分界不清，見圖3A。凍融3 d組和7 d組可見凍融區(qū)域表現(xiàn)為邊界清楚的類圓形壞死區(qū)，范圍逐漸縮小；HE染色示凍融完整的治療區(qū)邊界清晰，其內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，逐漸形成無結(jié)構(gòu)的組織，周邊可見少許纖維組織包繞及大量炎性細(xì)胞浸潤，呈炎性細(xì)胞反應(yīng)帶；凍融不全的治療區(qū)周邊可見腫瘤細(xì)胞殘留，見圖3B。凍融15 d組和30 d組的凍融區(qū)域隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)灰白色質(zhì)硬小結(jié)節(jié)；HE染色示在壞死區(qū)域周圍可見纖維增生帶，其內(nèi)可見小核類圓炎性細(xì)胞，炎性細(xì)胞逐漸減少，見圖3C。

圖3 凍融治療前后的HE染色結(jié)果（HE×200）Fig.3 HE staining results before and after cryoablation(HE×200)

2.5 凍融治療前后MVD-CD31、MVD-VEGF的表達(dá)情況

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，抗CD31抗體及抗VEGF抗體均結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞，鏡下呈棕黃色，見圖4～5；其中，對(duì)照組和凍融30 d組免疫組化染色均不明顯，但凍融3 d組可見多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，凍融7 d組在炎性細(xì)胞反應(yīng)帶可見大量細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈棕黃色，凍融15 d組可見細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色的炎性細(xì)胞。對(duì)照組及各凍融治療組組間MVD-CD31和MVD-VEGF的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=117.863，P＜0.001；F=274.784，P＜0.001），其中凍融3 d組和凍融7d組的MVD-CD31、MVD-VEGF表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加（MVD-CD31：P=0.009；P＜0.001；MVD-VEGF：P＜0.001；P＜0.001），且凍融7 d組最高；但凍融15 d組和凍融30 d組的MVD-CD31、MVD-VEGF表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（MVD-CD31：P=0.005；P＜0.001；MVD-VEGF：P＜0.001；P＜0.001），且凍融30 d組最低。見圖6。

圖4 凍融治療前后抗CD31抗體的免疫組化檢測(cè)結(jié)果（SP×200）Fig.4 Immunohistochemical staining results of anti-CD31 antibody before and after cryoablation(SP×200)

圖5 凍融治療前后抗VEGF抗體的免疫組化檢測(cè)結(jié)果（SP×200）Fig.5 Immunohistochemical staining results of anti-VEGF antibody before and after cryoablation(SP×200)

圖6 凍融治療前后MVD-CD31和MVD-VEGF的表達(dá)情況Fig.6 Expression levels of MVD-CD31 and MVD-VEGF before and after cryoablation

3 討論

氬氦刀凍融治療又稱冷凍治療，是通過使氬氦刀達(dá)到超低溫條件而將腫瘤組織殺滅的一種治療手段，也是肝癌微創(chuàng)治療的方法之一，尤其適用于不能手術(shù)切除的肝癌。多項(xiàng)臨床研究［7-9］顯示氬氦刀治療肝臟腫瘤具有良好的效果。不管是原發(fā)性肝癌還是轉(zhuǎn)移性肝癌，其預(yù)后均與血管變化密切相關(guān)［1-3］。腫瘤內(nèi)的MVD也是肝癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子［5］。正常情況下，肝動(dòng)脈供血占全肝血供的20%～25%，門靜脈為80%～85%，兩者之比為 1∶3～4。多數(shù)肝臟腫瘤包括VX2移植瘤血供豐富，且主要由肝動(dòng)脈供血。一般實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)均需要新生血管，而新生血管能引起血容積、灌注量及毛細(xì)血管通透性改變。另有研究［10］指出，氬氦刀療效易受病灶大小、形態(tài)和位置等因素影響，對(duì)于病灶較大、形態(tài)不規(guī)則的瘤體，消融過程中單個(gè)冰球難以覆蓋整個(gè)病灶；而多次消融時(shí)，相鄰冰球之間不能完全融合，會(huì)導(dǎo)致腫瘤部分殘留從而增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。氬氦刀冷凍治療作為肝癌患者重要的局部治療手段，其治療療效對(duì)制定后續(xù)治療策略具有重要意義，因此準(zhǔn)確評(píng)估氬氦刀冷凍治療效果尤為必要?；诖耍狙芯窟x擇目前較為成熟的兔VX2肝移植瘤模型，利用氬氦刀處理肝內(nèi)移植瘤，并分析治療前后的腫瘤微血管變化情況，以期反映氬氦刀冷凍治療在肝臟腫瘤中的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，用320排CT增強(qiáng)掃描計(jì)數(shù)的腫瘤數(shù)目與剖腹觀察計(jì)數(shù)腫瘤數(shù)目的符合率為96.7%，表明該法能較好地反映腫瘤數(shù)目。同時(shí)320排CT也能較好地反映血管分布和血流灌注情況，凍融治療前腫瘤組織血供豐富，在增強(qiáng)CT動(dòng)脈早期呈明顯強(qiáng)化表現(xiàn)，而治療后相應(yīng)區(qū)域始終無強(qiáng)化，表現(xiàn)為持續(xù)性血流灌注缺損。同時(shí)，HE染色見治療前腫瘤組織呈典型的巢狀分布特點(diǎn)，而治療后可見腫瘤組織缺血壞死呈無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織。上述表現(xiàn)也符合既往研究［11-13］報(bào)道的氬氦刀凍融治療“血管效應(yīng)”，即氬氦刀凍融治療會(huì)造成微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起血小板聚集、血液瘀滯、微血栓形成，進(jìn)一步導(dǎo)致凍融區(qū)域缺血壞死。對(duì)比凍融治療前后不同階段的影像學(xué)表現(xiàn)與相應(yīng)組織學(xué)HE染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)凍融治療3～7 d HE染色見治療區(qū)域內(nèi)部逐漸形成無細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)域，而CT可見治療區(qū)域呈囊樣壞死改變，三維重建則表現(xiàn)為空洞；15～30 d HE染色可見治療區(qū)域周圍的纖維增生修復(fù)，而CT顯示壞死范圍縮小，治療區(qū)周邊亦未見腫瘤復(fù)發(fā)，呈無明顯強(qiáng)化表現(xiàn)。由此可見，肝臟腫瘤經(jīng)氬氦刀凍融治療后病灶逐漸縮小，呈壞死-炎癥滲出-纖維修復(fù)的改變過程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)于腫瘤凍融完整的靶區(qū)，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)亦未見新生腫瘤；但凍融不完整則可見凍融靶區(qū)邊緣有腫瘤殘存。

腫瘤組織內(nèi)部的血供分布及新生血管空間分布有一定差異，呈不均衡性，單層面或局部幾個(gè)層面的腫瘤灌注參數(shù)并不能代表腫瘤整體的血流灌注特點(diǎn)［14］。MVD是目前常用于腫瘤血管生成的評(píng)價(jià)指標(biāo)，能反映腫瘤微血管變化，在一定程度上可彌補(bǔ)CT的不足。CD31是一種血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子。既往研究顯示，與其他血管內(nèi)皮標(biāo)志物比較，CD31能更精確、穩(wěn)定地反映腫瘤微血管數(shù)量［15］。VEGF作為腫瘤組織中最重要的血管生成因子，不僅可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖并延長(zhǎng)其存活時(shí)間，影響腫瘤血管生成和血管通透性，還直接與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)［16-17］。因此，本研究在SP免疫組化染色實(shí)驗(yàn)中分別采用抗CD31抗體和抗VEGF抗體檢測(cè)MVD。有研究指出，氬氦刀凍融治療后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)可發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)存在，3 d內(nèi)淋巴細(xì)胞聚集在腫瘤組織周圍，而巨噬細(xì)胞數(shù)量在7 d內(nèi)達(dá)到高峰，一直持續(xù)15 d左右［18］。此外，凍融治療的靶區(qū)中央還會(huì)發(fā)生壞死，但炎性細(xì)胞可在靶區(qū)外周誘導(dǎo)新血管形成和后期的纖維化改變［19］。本研究進(jìn)一步通過MVD監(jiān)測(cè)微血管變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氬氦刀凍融治療后MVD呈先升高后降低趨勢(shì)。結(jié)合HE染色和SP免疫組化染色結(jié)果，考慮凍融治療前期MVD增加可能與凍融治療后產(chǎn)生的腫瘤組織壞死物刺激機(jī)體免疫和炎癥系統(tǒng)，從而產(chǎn)生局部大量炎性細(xì)胞浸潤有關(guān)；而治療后期MVD減少可能與炎性細(xì)胞減少，且治療后腫瘤組織供血微血管數(shù)量也隨之減少有關(guān)。但是凍融治療前期在CT上未見治療區(qū)域明顯強(qiáng)化及血流高灌注表現(xiàn)，這一方面可能是由于氬氦刀凍融治療主要是通過冰晶的形成與解凍引起腫瘤供血血管損傷，易導(dǎo)致血栓形成，因此也減少了腫瘤組織的血流灌注量。另一方面可能是320排CT單層面或局部幾個(gè)層面的腫瘤灌注參數(shù)并不能代表腫瘤整體血流灌注特點(diǎn)［14］。

綜上所述，肝臟腫瘤經(jīng)氬氦刀凍融治療后逐漸縮小，腫瘤內(nèi)MVD呈先升高后降低趨勢(shì)，凍融治療最終能使肝臟腫瘤微血管數(shù)量明顯下降，具有良好的治療效果。但本研究為肝癌動(dòng)物模型研究，樣本量較少，凍融治療后MVD的變化及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。