陳海韶 劉震 李俊達 寧星 趙璐 李華道 潘靈輝

癌痛是臨床晚期癌癥患者最常見的癥狀之一，根據(jù)WHO最新公布的數(shù)據(jù)顯示，目前全球每年新增的癌癥患者中有51%～62%的患者伴隨不同程度的疼痛，其中60%為中重度疼痛［1］。研究顯示，約有40%的癌痛患者得不到有效治療和控制，其中高達75%～95%的晚期癌癥患者承受劇烈疼痛，且大部分癌性疼痛患者未得到充分治療，疼痛完全緩解率不足10%［2-3］。因此，緩解癌癥患者疼痛是臨床醫(yī)師亟需解決的一大難題。芋螺多肽AuIB從菲律賓食肉圓錐螺毒液中分離出來，含15個氨基酸殘基，能選擇性抑制α3β4煙堿乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）［4］。研究顯示，煙堿乙酰膽堿受體的多個不同亞型在體外培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)中表達并具有藥理活性，其中α3β4的煙堿乙酰膽堿受體（包括α3β4亞型）主要在傷害性背根神經(jīng)節(jié)中表達，表明該亞型可能參與傷害性和炎癥性神經(jīng)元信號傳導(dǎo)［5］。有研究報道尼古丁通過與nAChRs結(jié)合導(dǎo)致下游激活并促進腫瘤生長的相關(guān)蛋白，其中包括PI3K/AKT信號通路［6-7］。然而，芋螺多肽AuIB在骨癌痛中能否起到鎮(zhèn)痛作用尚不清楚。本研究通過建立骨癌痛小鼠模型，探討芋螺多肽AuIB在骨癌痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

芋螺多肽AuIB購自MCE（Med Chem Express）公司（貨號：HY-P1269）。PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT和磷酸化 AKT（p-AKT）均購自 Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。Von Frey纖維絲痛閾測試包購自美國Stoelting公司。

1.2 腫瘤細胞培養(yǎng)

小鼠來源的肺腺癌細胞Lewis購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所（中國上海）。將Lewis細胞接種至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 骨癌痛模型的建立

骨癌痛模型建立參考文獻［8］，將小鼠麻醉后，取仰臥位固定于操作臺上，腹部朝上，左側(cè)后肢剪毛，用75%乙醇消毒股骨及脛骨處皮膚；在膝關(guān)節(jié)處沿著股直肌肌腱方向切一長0.5～1.0 cm的皮膚切口，小心暴露髕骨，先用一次性無菌1 mL注射器針頭在髕骨沿股骨長軸方向穿刺打孔，然后換上10 μL微量注射器進入股骨骨髓腔，緩慢注入10 μL Lewis小鼠肺癌細胞（3.0×105個）至股骨；注射完畢后用骨蠟封住針孔；然后依次用75%酒精、雙氧水、碘伏嚴(yán)格消毒并縫合皮膚；待小鼠蘇醒后放回籠中。SHAM組小鼠于左側(cè)股骨骨髓腔內(nèi)注射生理鹽水10 μL。

1.4 實驗分組

36只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重（25±2）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（動物合格證號為SCXK桂2020-0003）。采用隨機數(shù)字法，將其分為6組（n=6）：假手術(shù)組（SHAM組）、骨癌痛組（BCP組）、生理鹽水對照組（NS組）、低劑量AuIB給藥組（AuIB1組）、中劑量AuIB給藥組（AuIB2組）和高劑量AuIB給藥組（AuIB3組）。SHAM組行假手術(shù)，BCP組股骨遠端注射3.0×105個Lewis細胞構(gòu)建骨癌痛模型，NS組、AuIB1組、AuIB2組和AuIB3組在股骨遠端接種腫瘤細胞后，每天分別腹腔注射100 μL生理鹽水、AuIB 0.6 mg/kg、AuIB 1.2 mg/kg和AuIB 2.4 mg/kg（根據(jù)前期細胞實驗確定各組中AuIB的相應(yīng)濃度，實驗中AuIB均溶于生理鹽水）。

1.5 X影像檢測各組小鼠股骨病理學(xué)改變

術(shù)后第14天取SHAM組和BCP組小鼠，用4%水合氯醛麻醉后以仰臥位固定，用X光機拍攝每只小鼠股骨，觀察股骨病理學(xué)改變情況，確認模型構(gòu)建是否成功。

1.6 組織切片HE染色觀察各組小鼠的組織病理學(xué)變化情況

術(shù)后第14天取SHAM組和BCP組小鼠術(shù)側(cè)股骨標(biāo)本，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，3%硝酸溶液脫鈣2周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟切片（5 μm），行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化情況。

1.7 機械縮足閾值測定

機械縮足閾值的具體測定方法參照文獻［9］。分別于Lewis小鼠肺腺癌細胞接種前1 d以及接種后3 d、5 d、7 d、11 d和14 d時檢測機械縮足閾值。將小鼠置于底部為金屬網(wǎng)格的透明樹脂玻璃籠中30 min以適應(yīng)環(huán)境，釆用遞增力度的Von Frey纖維絲（分別為0.007 g、0.02 g、0.04 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1 g、1.4 g、2 g、4 g）自足底下方垂直刺激小鼠后足底皮膚表面，每次持續(xù)6 s。小鼠對刺激出現(xiàn)快速縮足或藤足行為為陽性反應(yīng)，為陽性反應(yīng)時則釆用相鄰的低一級力度刺激，直至無陽性反應(yīng)產(chǎn)生。能引起陽性縮足反應(yīng)所需的最低力度記為縮足閾值。

1.8 Western blot法檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達水平

取同側(cè)脊髓L4-L5段背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層組織，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑，冰上裂解，離心，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性。取30～60 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后200 mA轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min；加入p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT抗體（稀釋比均為1∶1 000），4℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌3次；然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次。采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯影，Image Lab測量條帶灰度值，以磷酸化蛋白與總蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨癌痛模型的鑒定

X影像顯示，術(shù)后14 d時，SHAM組骨密度均勻，骨皮質(zhì)連續(xù)，見圖1A；而BCP組可見明顯的骨結(jié)構(gòu)破壞和損傷，骨密度不均勻，骨皮質(zhì)有明顯缺損，組織周圍出現(xiàn)明顯腫脹，見圖1B。顯微鏡下可見SHAM組骨膜完整且骨質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，骨小梁致密且寬，骨細胞清晰可見，且可見新生骨組織，見圖1C；而BCP組骨膜缺損且骨質(zhì)明顯破壞，骨小梁排列紊亂，伴隨腫瘤細胞在骨髓腔內(nèi)浸潤，見圖1D。上述結(jié)果說明骨癌痛模型建模成功。

圖1 SHAM組和BCP組小鼠的X線影像和HE染色結(jié)果Fig.1 The X-ray images and HE staining in SHAM group and BCP group

2.2 芋螺多肽AuIB對骨癌痛小鼠機械痛行為的影響

各組小鼠術(shù)前1 d、術(shù)后3 d、術(shù)后5 d的機械縮足閾值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；術(shù)后7d，與SHAM組相比，BCP組機械縮足閾值明顯降低（P＜0.05），說明此時小鼠出現(xiàn)機械痛敏；與相同時間點的BCP組相比，AuIB1組在術(shù)后14 d出現(xiàn)機械縮足閾值明顯升高（P＜0.05），AuIB2組在術(shù)后11 d出現(xiàn)機械縮足閾值明顯升高（P＜0.05），AuIB3組在術(shù)后7 d出現(xiàn)機械縮足閾值明顯升高（P＜0.05），見表1。說明AuIB可改善骨癌痛小鼠機械痛行為且呈濃度依賴性和時間依賴性。

表1 各組小鼠的機械縮足閾值比較［g，（±s）］Tab.1 Comparison of the mechanical paw withdrawal threshold in different groups of mice［g,(±s)］

表1 各組小鼠的機械縮足閾值比較［g，（±s）］Tab.1 Comparison of the mechanical paw withdrawal threshold in different groups of mice［g,(±s)］

#P＜0.05,vs SHAM group at the same time point;*P＜0.05,vs BCP group at the same time point

Group SHAM BCP NS AuIB1 AuIB2 AuIB3 n 6 6 6 6 6 6 F P Preoperative 1 d 1.33±0.16 1.30±0.39 1.37±0.37 1.27±0.21 1.33±0.52 1.37±0.37 0.072 0.996 Postoperative 3 d 0.63±0.20 0.53±0.10 0.60±0.22 0.57±0.23 0.67±0.16 0.63±0.29 0.327 0.893 Postoperative 5 d 0.70±0.24 0.63±0.20 0.50±0.11 0.53±0.28 0.57±0.08 0.60±0.22 0.783 0.570 Postoperative 7 d 0.93±0.30 0.35±0.22#0.39±0.20#0.50±0.32#0.53±0.28#0.77±0.27*4.334 0.004 Postoperative 11 d 1.13±0.33 0.26±0.16#0.27±0.23#0.43±0.23#0.60±0.22#*0.80±0.22#*13.488 0.001 Postoperative 14 d 1.20±0.22 0.16±0.13#0.16±0.14#0.60±0.22#*0.77±0.27#*0.93±0.30#*21.660 0.001

2.3 芋螺多肽AuIB對骨癌痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響

在背根神經(jīng)節(jié)，與SHAM組相比，BCP組、NS組和AuIB3組中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均顯著增加（均P＜0.05）；與BCP組相比，AuIB3組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均降低（均P＜0.05），見圖2A～C。相同的結(jié)果可以在大腦皮層中觀察到，見圖2D～F。

圖2 芋螺多肽AuIB對骨癌痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Effects of α-Conotoxin AuIB on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in dorsal root ganglia and cerebral cortex of mice with bone cancer pain

3 討論

癌痛是腫瘤患者后期最常見的并發(fā)癥，導(dǎo)致骨癌痛的機制較復(fù)雜，目前主要認為癌癥誘導(dǎo)的骨痛是一種混合機制的疼痛狀態(tài)表現(xiàn)出的神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛，是對周圍組織和神經(jīng)有特殊改變以及對脊髓水平獨特的神經(jīng)化學(xué)變化，但與神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛不同的是，骨癌痛的特點是突發(fā)性和高強度性［10-12］。因此，骨癌痛是一種復(fù)雜的綜合征，不但涉及炎癥和神經(jīng)病變，更有缺血性和腫物壓迫特異性機制。短暫的高爆發(fā)性疼痛也是目前臨床上常面臨的問題，主要依靠嗎啡止痛，但該法止痛并不充分［13］。

海洋藥物由于獨特的結(jié)構(gòu)及特異高效的生物活性而成為當(dāng)今的研究熱點之一，目前越來越受國內(nèi)外制藥研究者的關(guān)注［14］。如，來源于加勒比海荔枝海綿的阿糖胞苷，由于能抑制細胞DNA合成，已成為臨床上急性粒細胞白血病標(biāo)準(zhǔn)的治療藥物［15］。從河豚提取的替曲朵辛能選擇性阻滯電壓門控鈉通道而達到鎮(zhèn)痛作用，目前已進入Ⅲ期臨床試驗［16］。但目前關(guān)于芋螺多肽的研究仍不多，芋螺多肽AuIB對癌痛是否具有鎮(zhèn)痛作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建骨癌痛小鼠模型探討芋螺多肽的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在建模第7天，小鼠出現(xiàn)明顯的跛行姿態(tài)；在建模第14天，X影像提示骨質(zhì)明顯破壞，病理學(xué)提示癌細胞浸潤，表明骨癌痛小鼠模型構(gòu)建成功。進一步在小鼠模型中腹腔注射芋螺多肽AuIB，發(fā)現(xiàn)芋螺多肽AuIB能改善小鼠的機械痛行為，并且隨著藥物濃度的升高，可見小鼠縮足閾值升高的轉(zhuǎn)折點提前，AuIB1組在術(shù)后14 d才升高，而AuIB3組在術(shù)后7 d已出現(xiàn)升高，說明AuIB可改善骨癌痛小鼠機械痛行為且呈濃度依賴性。

PI3K/AKT信號通路是聯(lián)系細胞內(nèi)外信號傳遞與細胞應(yīng)答效應(yīng)的橋梁之一，廣泛存在于機體多種細胞中，且參與細胞代謝、增殖、分化、調(diào)亡等多種生理過程［17］。越來越多的研究顯示PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)疼痛方面發(fā)揮重要作用。如SONG等［18］研究顯示，柚皮素可能通過下調(diào)PI3K信號通路減輕大鼠骨癌痛。李洪波等［19］也報道背根神經(jīng)節(jié)IL-17可能通過激活P13K/AKT信號通路參與大鼠骨癌痛的維持。背根神經(jīng)節(jié)是痛感傳入的初級神經(jīng)元，炎癥會導(dǎo)致p-AKT在背根神經(jīng)節(jié)中表達上調(diào)，從而引起痛覺過敏［20］。本研究采用不同劑量AuIB注射，發(fā)現(xiàn)均能緩解小鼠的機械痛行為，同時在蛋白水平上通過Western blot法檢測背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射AuIB后小鼠背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均降低，提示AuIB可能通過下調(diào)PI3K/AKT信號通路參與骨癌痛的調(diào)節(jié)。

綜上所述，芋螺多肽AuIB可以減輕骨癌痛小鼠的機械痛閾，且可能是通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路實現(xiàn)。但是AuIB是通過其既定功能阻斷nAChR還是通過其他未知靶點產(chǎn)生作用仍不清楚，未來可以在使用nAChRs激動劑的情況下進一步驗證。