楊程茹，王 英，李 瑩，張吉生，曾令怡，胡可望，張曉麗

(1. 佳木斯大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154007；2. 重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院檢驗科，重慶 402160；3. 重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 402160)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, KP)是一種臨床常見病原體，可引起傷口、呼吸道、泌尿道和胸腔積液多種感染[1]。由于碳青霉烯類抗生素的使用，導致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbape-nem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)已在全球范圍內(nèi)流行。據(jù)報道，北美、南美、歐洲和亞洲CRKP的病死率分別為33.24%、46.71%、50.06%和44.82%，嚴重威脅著全球公共安全[2]。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRKP主要的耐藥機制，因編碼碳青霉烯酶基因可位于基因組(染色體)DNA或質粒上，并可通過質粒進行水平轉移，所以在同一醫(yī)院同一病區(qū)更易發(fā)生CRKP克隆傳播和水平傳播。本研究分析重癥監(jiān)護病房(ICU)臨床CRKP菌株，明確其耐藥機制及快速傳播途徑，為醫(yī)院感染控制提供分子流行病學依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院2018年7月—2020年7月ICU患者分離的51株CRKP，無重復分離株。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗 采用法國生物梅里埃公司VITEK 2 Compact 全自動微生物分析儀鑒定菌株以及進行藥敏試驗，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)2020年版指南的規(guī)定，選取對碳青霉烯類(亞胺培南、美羅培南或厄他培南)耐藥的臨床分離株。所有患者信息均從電子病歷中獲得，包括年齡、性別、入住ICU的時間、診斷和轉歸等信息。微量肉湯稀釋法檢測亞胺培南(IMP)、美羅培南(MEM)、左氧氟沙星(LEV)、阿米卡星(AK)、多粘菌素B(PB)、替加環(huán)素(TIG)和頭孢他啶/阿維巴坦(CAZ/AVI)的最低抑菌濃度(MIC)。ATCC 25922、ATCC 700603和BAA-1705作為質控菌株，3次平行檢測。TIG藥敏結果根據(jù)歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(EUCAST)的標準判讀，其他抗菌藥物的藥敏結果根據(jù)2020年版CLSI標準判讀。接合菌株EC600由浙江邵逸夫醫(yī)院俞云松教授團隊惠贈。

1.3 高黏液表型及耐藥表型檢測 采用拉絲試驗方法，用接種環(huán)挑取血瓊脂平板上新鮮菌落進行牽拉，黏液絲形成且長度≥5 mm則判斷為高黏液表型陽性，反之判斷為陰性。同時采用mCIM和eCIM方法檢測CRKP中碳青霉烯酶。按2020年版CLSI操作。

1.4 碳青霉烯酶等耐藥基因和毒力基因檢測 采用煮沸法[3]提取菌株DNA。參照文獻[4-7]設計引物，引物由上海生工生物工程公司合成，包括碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP-4、blaIMP-8、blaVIM-1、blaVIM-2和blaOXA-48)、ESBLs基因(blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9)、AmpC β-內(nèi)酰胺酶基因(blaDHA和blaACC)、喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6’)lb-cr]，以及質粒介導的多粘菌素耐藥基因(mcr-1和mcr-9)，染色體介導的多粘菌素耐藥基因(mgrB、pmrA、pmrB、phoP和phoQ)。毒力基因包括：fim-H、magA、aero、allS、iroNB、kpn、mrkD、rmpA、uge和wcaG。陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進行測序，并在BLAST中比對測序結果(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 。

1.5 質粒接合試驗 供體菌(CRKP)和受體菌(大腸埃希菌EC600)1∶3混合于LB肉湯中，將混合物置于貼有濾膜的血平板上，在雙抗LB平板(含利福平600 μg/mL，美羅培南1 μg/mL)上篩選接合子。雙抗平板上生長的菌株檢測16S rRNA確認為大腸埃希菌，并檢測耐藥基因。

1.6 同源性分析 采用多位點序列分型(MLST)和脈沖場凝膠電泳(PFGE)進行同源性分析。 擴增肺炎克雷伯菌7個管家基因進行MLST分析(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html)。將PCR擴增陽性產(chǎn)物的測序序列上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)。限制性內(nèi)切酶Xba1在37℃下酶切，用Bio-Rad Chef Mapper系統(tǒng)在1%脈沖場認證的瓊脂糖凝膠上分離，18 h，14℃，電壓6 V/cm，使用BioNumerics軟件分析條帶圖譜。分析采用未加權對組法和算術平均法(UPGMA)，用dice系數(shù)判斷菌株的親緣關系，聚類定義為相似度≥80%。

2 結果

2.1 菌株來源及藥敏結果 51株CRKP標本來源分別為痰31株(60.8%)，肺泡灌洗液13株(25.5%)，尿4株(7.8%)，血2株(3.9%)，分泌物1株(2.0%)。根據(jù)ICU分布圖(圖1)，標本來源Ⅰ區(qū)13株(25.5%)，Ⅱ區(qū)6株(11.8%)，Ⅲ區(qū)8株(15.7%)，Ⅳ區(qū)13株(25.5%)，Ⅴ區(qū)5株(9.8%)，Ⅵ區(qū)0株以及Ⅶ區(qū)6株 (11.8%)。45例(88.2%)患者有肺部疾病，其中44例(86.3%)接受了侵入性手術治療(氣管插管或有創(chuàng)通氣)。51株CRKP對IMP、MEM、頭孢他啶(CAZ)、LEV、AK、PB和TIG的耐藥率分別為96.1%(49株)、98.0%(50株)、100.0%(51株)、98.0%(50株)、49.0%(25株)、64.7%(33株)和3.9%(2株)，對CAZ/AVI敏感率100%，見圖2。

2.2 毒力及耐藥表型檢測 51株CRKP中，僅4株(7.8%)在拉絲試驗中表現(xiàn)為高黏液表型。mCIM試驗陽性率為96.1%(49/51)，其中mCIM陽性的CRKP中，1株eCIM陽性。見圖3。

2.3 耐藥基因和毒力基因檢測結果 51株CRKP檢出1種碳青霉烯類耐藥基因blaKPC-2，3種ESBLs基因(blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-65)，未檢出AmpC β-內(nèi)酰胺酶基因(blaDHA、blaACC)。質粒介導的喹諾酮類耐藥基因(PMQR)僅檢出qnrS和aac(6’)lb-cr，均為1株。33株PB耐藥菌株未檢出質粒介導的PB耐藥基因mcr-1和mcr-9，而染色體介導的PB耐藥基因pmrA、pmrB、phoP和phoQ均表達，其中pmrA基因中未發(fā)現(xiàn)突變；但在pmrB基因發(fā)現(xiàn)了N8T、T228A、R256G、L254F、A246T 5種不同類型的突變，在phoP基因中發(fā)現(xiàn)了I201F突變，在phoQ基因中發(fā)現(xiàn)了D150G的突變；在mgrB基因中，也發(fā)現(xiàn)了IS3、IS1341和IS5不同類型的插入序列。檢出毒力基因uge、mrkD、kpn和fim-H，未檢測到wcaG、iroNB、allS和magA。僅1株菌(CRKP59)同時檢出aero和rmpA。見表1。

表1 51株CRKP菌株耐藥基因和毒力基因檢出情況

2.4 同源性分析 51株CRKP依據(jù)MLST分析共鑒定出2種ST分型，其中ST11型50株(98.0%)，ST1373型1株(2.0%)。根據(jù)國際標準對PFGE結果進行解釋，將所有分離物分為5個不同的克隆群(A～E)，A群32株(62.7%)，B群11株(21.6%)，C群4株(7.8%)，D群3株(5.9%)，以上均屬于ST11；E群(2.0%)1株，屬于ST1373。兩種檢測方法均顯示ICU中CRKP具有很高的同源性。見圖2。

2.5 接合試驗結果 49株攜帶blaKPC-2基因的菌株進行接合試驗，6株CRKP接合成功，接合成功率為12.2%。采用PCR檢測接合子耐藥基因攜帶情況，采用藥敏試驗檢測接合子藥敏情況，原始菌株與接合子在接合前后各基因的攜帶情況及MIC值變化見表2。

表2 CRKP原始菌株及接合子的耐藥基因攜帶情況及藥敏結果

3 討論

2019年CHINET細菌耐藥檢測網(wǎng)報道，全國、重慶和ICU CRKP檢出率分別由2014年的6.4%、2.5%和14.7%上升至2019年的10.9%、5.5%和23%[8]，應加強抗菌藥物合理使用的管理以及醫(yī)院感染防控工作，減緩CRKP檢出率的持續(xù)上升。本研究針對2018年7月—2020年7月重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院ICU CRKP暴發(fā)進行回顧性分析，為感染控制及其治療提供實驗室數(shù)據(jù)。

國內(nèi)流行的CRKP主要以攜帶blaKPC-2基因的ST11為主[9-10]，ICU患者CRKP感染率以及病死率均很高[11]。本研究中，49株mCIM陽性的菌株均攜帶KPC-2耐藥基因，且MLST均屬于ST11，與我國流行的基因型及克隆型一致[9]。同時所有菌株通過PFGE分成五簇，其中A、B、C、D四個簇的同源性非常高，均是ST11型。在兩種同源性分析方法中CRKP59均獨立成一型，分別為ST1373和E簇。分析ICU空間位置分布及患者感染時間圖(圖1、3)得出，攜帶blaKPC-2和blaSHV基因的ST11耐藥菌首先出現(xiàn)在Ⅳ區(qū)，并逐漸擴散到除Ⅵ區(qū)(可能與該區(qū)床位較少有關)外的其他相鄰區(qū)域，在Ⅰ區(qū)停留的時間最長，其中Ⅰ和Ⅳ區(qū)檢出數(shù)最高(均為13株)，以A簇為主(20株)。單獨成一型的CRKP59菌株在Ⅲ區(qū)檢出，并且與該區(qū)上次耐藥菌檢出時間間隔大約6個月。攜帶blaKPC-2基因的ST11型CRKP暴發(fā)時間主要集中在2019年1月—10月，持續(xù)10個月之久。醫(yī)院受新型冠狀病毒肺炎疫情的影響，從2020年1月開始患者量有所下降，CRKP主要集中在Ⅰ區(qū)。針對此次ST11型CRKP在ICU暴發(fā)流行可追溯到某一菌株在不同區(qū)域間的水平傳播，需重視對耐藥菌的監(jiān)測及追蹤，及時與病區(qū)工作人員溝通，加強醫(yī)院感染防控意識，以及病區(qū)的衛(wèi)生與儀器設備的清潔消毒及醫(yī)護工作者手衛(wèi)生的管理，更好地控制CRKP的播散。

此次暴發(fā)的菌株中，均對至少一種碳青霉烯類藥物耐藥，表型結果提示ICU內(nèi)CRKP的耐藥機制以產(chǎn)絲氨酸酶為主，僅有1株(CRKP52)eCIM陽性，但PCR方法未檢測到本研究所用引物覆蓋范圍內(nèi)的金屬β-內(nèi)酰胺酶基因(MBLs)，因此推測該細菌可能會產(chǎn)生其他超出范圍的MBLs，如blaSPM、blaGIM、blaSIM和blaAIM。KPC-2是本研究中的關鍵酶，其余耐藥基因也有檢出，與之前報道[12]一致，表明攜帶多種滅活酶是多重耐藥的主要機制。攜帶blaKPC-2基因是ICU中大多數(shù)CRKP產(chǎn)生耐藥的主要原因，blaKPC-2是一種典型的質粒介導的耐藥基因，廣泛分布于不同大小和類型的質粒中，這些質粒通常包含幾個編碼對氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類等耐藥的其他耐藥基因，并且高風險克隆促進不同的質粒、移動元件和耐藥基因在CRKP中傳播[13]，接合試驗的成功證明耐藥質粒的可轉移性。blaTEM基因通常是blaKPC-2基因遺傳環(huán)境的一部分[14]，結果顯示，這兩個基因都在質粒內(nèi)轉移。在歐洲和美國，攜帶blaKPC基因的移動元件以Tn4401轉座子為主，而我國ST11 CRKP以Tn1721轉座子為主，說明blaKPC基因周圍環(huán)境存在一定的可變性及多樣性，是blaKPC基因在全球有效傳播的主要原因[15]。耐藥質粒的水平傳遞可以加速多重耐藥基因的擴散，介導多重耐藥菌的產(chǎn)生。接合試驗結果還表明，接合子的碳青霉烯類抗生素MIC值降低，說明還有其他耐藥原因，如膜蛋白、外排泵等不隨質粒轉移。

除碳青霉烯類藥物外，ICU患者對頭孢菌素類、AK、LEV表現(xiàn)出不同程度的耐藥。值得注意的是，由于未檢測到很高的PMQR，推測可能與染色體介導的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(QRDR)有關[16]，這些CRKP可能在gyrA、parC基因和其他位點有突變，同時接合子對喹諾酮類藥物敏感性提高也證實了該假設，說明耐藥性基因沒有隨質粒轉移，而是可能存在其他的耐藥原因，如靶位染色體突變或者孔蛋白丟失等等。同時檢出較高的多粘菌素耐藥性(PR)，由于多粘菌素被認為是治療CRKP感染的最后手段，盡管多粘菌素具有毒性強等不良反應，但由于效果好，在過去的幾年中還是被廣泛地使用[17]。多粘菌素暴露是PR出現(xiàn)的主要原因[17]，但本研究中，僅1例患者接受了PB的治療。所以檢測了多粘菌素相關耐藥基因，未檢測到mcr-1及mcr-9基因，但與染色體介導的雙組份調節(jié)基因phoP/phoQ以及pmrB的突變、mgrB基因中插入序列的存在，其他學者的研究[18-19]也發(fā)現(xiàn)了類似結果，并且CRKP接合子對多粘菌素的敏感性提高，均表明研究中染色體變化是介導多粘菌素耐藥的重要原因之一。本研究中所有菌株對CAZ/AVI均敏感，該藥可作為該院產(chǎn)KPC酶CRKP的一種有效治療選擇。鑒定出的接合子CRKPJ55對CAZ/AVI產(chǎn)生耐藥，而供體菌并未表現(xiàn)耐藥，KPC-2沒有發(fā)生氨基酸變異，后續(xù)研究將進一步分析其與抗生素壓力下轉錄組表達的差異是否有關。

由于拉絲試驗對CRKP的毒力檢測敏感率低，有學者[20]將拉絲試驗和rmpA基因均陽性的菌株定義為高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)。本組研究發(fā)現(xiàn)，ICU中僅檢出1株(2.0%)hvKP(拉絲試驗陽性的基礎上同時攜帶rmpA和aero)，低于其他報道[21]。研究鑒定的ST1373 hvKP對IMP、LEV、AK和TIG保持敏感性，可能是由于攜帶的耐藥基因數(shù)量較少所致。然而，除了ST1373 hvKP以外的其他菌株，與細菌定殖、菌毛黏附相關的fimH、mrkD和kpn，與細菌脂多糖相關的uge毒力基因檢出率高，表明毒力風險依然存在。88.2%的患者患有肺部疾病，60.8%的標本來自痰，由于患者呼吸受阻，44例(86.2%)患者接受了氣管插管和氣管切開等侵入性手術。研究[22]指出，有創(chuàng)機械通氣和腸外營養(yǎng)≥48 h是感染的危險因素。因此，應盡早拆除ICU中不必要的侵入性操作，預防醫(yī)院獲得性感染，并盡快建立腸內(nèi)營養(yǎng)，以減少危險因素。

總之，針對此次 ST11 CRKP在該院ICU的暴發(fā)流行，耐藥機制主要為攜帶blaKPC-2基因，并可以通過接合水平傳播，雖然未對ICU污染區(qū)域進行長期、系統(tǒng)的抽樣，但有必要了解CRKP的動態(tài)分布和傳播，這是臨床治療中不容忽視的問題。及時、有效地采取感染控制措施對于減輕和控制醫(yī)院感染傳播和暴發(fā)的風險至關重要。根據(jù)歐洲臨床微生物學和傳染病學會(ESCMID)的指南，應實施手衛(wèi)生教育計劃，采取接觸預防措施，并使用警告碼及時識別CRKP感染患者，并應隔離感染患者。此外，應實施積極篩查培養(yǎng)和抗菌藥物使用管理計劃，以減少多重耐藥革蘭陰性菌在醫(yī)院患者中的傳播，特別是在ICU中[23]。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。