李 靜，胡同平，張文蘭，李雅倩，李洪甫

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus， SA)作為一種侵襲性細(xì)菌，可存在于不同組織類型中而引起多種疾病[1]，從淺表皮膚損傷到危及生命的中毒或菌血癥。SA廣泛的致病性和對(duì)抗菌藥物的耐藥性均由所攜帶的毒力基因所致。毒力基因編碼產(chǎn)物可以表達(dá)分泌多種與細(xì)胞表面相關(guān)的毒力因子，從而促進(jìn)SA與宿主細(xì)胞外基質(zhì)成分黏附、對(duì)宿主細(xì)胞的損傷、與宿主免疫系統(tǒng)的對(duì)抗[2]。已知SA至少有25種不同的毒素、15種微生物表面成分、20種免疫逃避分子和其他幾種毒力因子。同時(shí)SA菌株又是異質(zhì)性的，不同的耐藥性和毒力模式?jīng)Q定宿主不同的臨床感染程度和結(jié)局。鑒于SA，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus， MRSA)對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性，給臨床治療帶來(lái)極大困難，因此，從基因水平闡述SA的致病機(jī)制，對(duì)于制定新的治療措施至關(guān)重要?，F(xiàn)將臨床分離SA的臨床特征、毒力基因攜帶情況及耐藥情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2018年1月—2020年12月包頭市參加全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)11所成員醫(yī)院臨床分離的SA，標(biāo)本主要來(lái)源于上述醫(yī)院門診及住院患者的臨床送檢標(biāo)本，所有標(biāo)本均來(lái)源于不同患者。將收集到的菌株按照醫(yī)院進(jìn)行分層抽樣，從中抽取樣本作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)。質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購(gòu)于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 資料來(lái)源 回顧性分析納入菌株來(lái)源患者的病歷資料，收集臨床資料，包括年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、住院時(shí)間、預(yù)后和感染相關(guān)指標(biāo)。

1.3 分組 根據(jù)患者預(yù)后情況的不同將預(yù)后分為治愈：治愈出院；未治愈：自動(dòng)出院(包括轉(zhuǎn)院)；死亡。

1.4 儀器及試劑 XN-10(B4)全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀、ACLTOP700全自動(dòng)血凝儀、PA-990特定蛋白儀、Cobas e411羅氏電化學(xué)發(fā)光儀、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad)、凝膠成像儀及凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)、VITEK 2 Compact微生物分析儀(法國(guó)梅里埃)；MH瓊脂和含5%脫纖維羊血MH瓊脂為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品、抗菌藥物紙片和利奈唑胺E試驗(yàn)條為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品、青霉素和萬(wàn)古霉素E試驗(yàn)條為鄭州安圖生物工程股份有限公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒、PCR試劑、DNA marker 以及PCR引物均來(lái)自北京瀚海拓新公司產(chǎn)品。

1.5 方法

1.5.1 感染相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 采用XN-10(B4)全自動(dòng)模塊式血液體液分析儀檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(N)、中性粒細(xì)胞百分比(N%)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)；ACLTOP700全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)纖維蛋白原(FIB)、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)、凝血酶原時(shí)間(PT)；PA-990特定蛋白儀檢測(cè)血清淀粉樣蛋白(SAA)；Cobas e411羅氏電化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)降鈣素原(PCT)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)。

1.5.2 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2019年版[3]文件推薦的方法進(jìn)行判斷，采用KB法聯(lián)合全自動(dòng)藥敏儀法。采用法國(guó)生物梅里埃VITEK 2 Compact或美國(guó)BD公司的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏儀及配套檢測(cè)卡進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.5.3 DNA提取 將收集的金黃色葡萄球菌接種到血平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取菌落至裂解液中制成菌懸液后，按照基因組提取試劑盒說(shuō)明提取金黃色葡萄球菌基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 毒力基因的檢測(cè) 采用PCR法檢測(cè)毒力基因的表達(dá)情況。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 60 s，退火55℃ 60 s，延伸72℃ 60 s，共25個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 10 min。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為人工合成的目標(biāo)基因DNA片段，陰性對(duì)照為蒸餾水。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察和保存擴(kuò)增結(jié)果。PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列和擴(kuò)增片段大小

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用WHONET 5.6及SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)或χ2分割法進(jìn)行比較；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)計(jì)量資料以中位數(shù)表示。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 收集菌株情況 2018年1月—2020年12月共收集SA 2 452株。2 452例SA感染患者中外科感染(包括膿腫、傷口感染)932例，呼吸道感染504例，血流感染172例，其他類型感染844例。

2.2 不同感染類型患者的臨床特征 2 452例SA感染患者以男性為主(68.23%)，不同感染類型SA的患者人群分布也以男性為主。不同性別、年齡SA感染患者的感染類型分布情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。外科感染、呼吸道感染、血流感染主要以<60歲患者為主。外科感染患者住院時(shí)間>2周的比率較高，占39.21%。呼吸道感染SA患者的病死率較高，為76.39%。見(jiàn)表2。

表2 不同感染類型SA感染患者的臨床特征

2.3 不同感染類型患者的感染相關(guān)指標(biāo)特征 無(wú)論何種感染類型，WBC、N%、PLT、CRP、IL-6均高于正常范圍。不同感染類型患者的WBC、N、N%、PLT、PT水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表3。不同感染類型患者的CRP、PCT、IL-6、D-D、FDP水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 不同感染類型患者的感染相關(guān)指標(biāo)特征

表4 不同感染類型患者的感染相關(guān)指標(biāo)特征[M(P25, P75)]

2.4 不同感染類型SA毒力基因檢出情況 將2 452株SA按照醫(yī)院進(jìn)行分層抽樣，從中抽取一個(gè)容量為80的樣本作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)。其中38株SA來(lái)源于外科感染標(biāo)本，9株來(lái)源于呼吸道感染標(biāo)本，10株來(lái)源于血流感染標(biāo)本，23株來(lái)源其他感染標(biāo)本。80株菌株幾乎都攜帶clfa(100.00%)、

clfb(98.75%)、scn(93.75%)、coa(97.50%)、nuc(100.00%)、hla(100.00%)、hld(100.00%)基因。sak基因陽(yáng)性株72株(90.00%)，fnbB基因陽(yáng)性株39株(48.75%)，eno基因陽(yáng)性株69株(86.25%)，ebps基因陽(yáng)性株12株(15.00%)，chp基因陽(yáng)性株63株(78.75%)，cna基因陽(yáng)性株24株(30.00%)。bbp基因僅存在于外科感染和血流感染(共3株，3.75%)，eta基因僅在其他感染中攜帶(1株，1.25%)，pvl和seb基因陽(yáng)性株分別為23株(28.75%)、26株(32.50%)，tsst基因僅在外科感染和呼吸道感染中攜帶(2株，2.50%)，seh基因存在于外科感染和血流感染(5株，6.25%)。LukED基因陽(yáng)性株26株(32.50%)，且在外科感染中的檢出率高于其他3種感染類型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。毒力基因電泳圖見(jiàn)圖1。

表5 不同感染類型SA毒力基因檢出情況[株(%)]

圖1 毒力基因pvl擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1Electrophoretic map of amplified product ofpvlvirulence gene

表6 不同感染類型檢出MRSA與MSSA對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率(%)

3 討論

本研究中，不同感染類型的SA感染患者人群分布以男性為主。Katoulis等[4]研究發(fā)現(xiàn)，化膿性汗腺炎/痤瘡是一種好發(fā)于腋窩、腹股溝和肛門生殖器汗腺承載區(qū)域的毛囊皮膚病，患有該類疾病的人群，其SA定植率略高于普通人群。與女性相比，男性因雄激素作用，毛發(fā)長(zhǎng)，油脂分泌多，使SA定植率更高[5]，從而好發(fā)SA感染。研究[6]表明，SA感染隨年齡增長(zhǎng)而增加，而Anderson等[7]表明SA感染在年輕患者中更常見(jiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)SA感染患者多數(shù)<60歲，此結(jié)果是否與SA體表攜帶有關(guān)還有待研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，外科感染SA患者住院日數(shù)>2周的比率較高，其次為呼吸道感染；呼吸道感染SA患者的病死率較高，其次為血流感染。本研究2 452例病例中，血流感染SA患者多數(shù)患有血液病、免疫缺陷疾病等全身反應(yīng)性疾??；而呼吸道感染SA患者多數(shù)合并其他疾病，如腦卒中、腦外傷等，多數(shù)長(zhǎng)期臥床，易增加治療難度，延長(zhǎng)住院時(shí)間。國(guó)外研究[8-9]表明，長(zhǎng)時(shí)間住院、中心靜脈置管等是MRSA感染的危險(xiǎn)因素，因此呼吸道感染及血流感染SA患者增加了MRSA感染的風(fēng)險(xiǎn)，常常預(yù)后不佳，病死率高。

血流感染SA患者感染時(shí)常導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，使WBC、N、N%、PT、PLT等感染指標(biāo)發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，血流感染W(wǎng)BC、N、N%、PT、CRP、PCT、IL-6和FDP水平均高于其他三種感染類型。研究[10]表明PCT水平能反映膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度及評(píng)價(jià)后續(xù)治療效果；而D-D、FDP水平在血流感染中升高后續(xù)可預(yù)測(cè)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)。因此，積極監(jiān)測(cè)血流感染SA患者的CRP、PCT、IL-6、D-D和FDP等感染指標(biāo)，對(duì)感染的診斷及治療具有重要意義。

本研究對(duì)80株SA的20個(gè)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)80株SA均攜帶clfa、nuc、hla、hld基因，90%以上的菌株攜帶clfb、scn、coa、sak基因。其中黏附素基因fnbB基因檢出率為48.75%，bbp基因檢出率為3.75%，白細(xì)胞毒素pvl基因檢出率為28.75%，LukED基因在外科感染中的檢出率高于其他三種感染類型。

SA生物被膜的形成可以使細(xì)菌躲避人體免疫系統(tǒng)的攻擊，從而導(dǎo)致慢性感染和復(fù)發(fā)感染。研究[11]表明，70%以上的感染與生物膜的形成有關(guān)，而致病性的SA在表面形成生物膜的能力則更強(qiáng)。生物膜的形成通常被描述為兩個(gè)主要階段：黏附和增殖。黏附階段主要由黏附素基因所介導(dǎo)，該基因主要包括clfa、clfb、fnbA、fnbB、cna、bbp、ebps和eno。clfa基因所表達(dá)的纖維蛋白原結(jié)合蛋白，能夠與血小板結(jié)合，并促進(jìn)SA在血漿中的聚集[12]。而clfb基因的表達(dá)使SA具有定植于鼻上皮細(xì)胞的能力[13]，同時(shí)，該基因也是導(dǎo)致膿毒癥轉(zhuǎn)移性感染的關(guān)鍵毒力因子。本研究中，clfa基因的檢出率為100%，與研究[14]結(jié)果一致。clfa和clfb基因的高流行率表明該基因在SA的致病性以及不同表面的定植中起決定性作用。

fnbA和fnbB基因表達(dá)的纖維連接蛋白結(jié)合蛋白可以作為信號(hào)細(xì)胞和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排的中介物，同時(shí)該基因能夠促進(jìn)SA在組織中的侵襲[15]。fnbB基因在角膜炎、骨髓炎、醫(yī)療器械表面陽(yáng)性率較高，在骨科感染患者分離的菌株中也常檢測(cè)到。本研究fnbB基因的檢出率為48.75%，在Soltani等[16]的研究中其檢出率為43.6%，而在一項(xiàng)關(guān)于血流感染的研究[17]中其檢出率為29.5%，表明fnbB基因具有異質(zhì)性特點(diǎn)，在不同的臨床標(biāo)本中其檢出率具有差異。

本研究bbp基因的檢出率僅為3.75%，與Kot等[18]結(jié)論類似。既往研究[19]表明，SA攜帶bbp基因比攜帶其他生物膜相關(guān)的基因產(chǎn)生更強(qiáng)的生物膜，但由于其流行率較低導(dǎo)致研究受到限制。bbp基因可以編碼一種與骨涎蛋白有親和力的蛋白質(zhì)，也有研究[20]表明其與血源性骨髓炎或關(guān)節(jié)炎顯著相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)也解釋了本研究中攜帶bbp基因的3例患者，其中2例腰椎管狹窄，另外1例患有急性骨髓炎。

白細(xì)胞毒素pvl是臨床感染的內(nèi)源性宿主，對(duì)中性粒細(xì)胞有重要的細(xì)胞毒作用[21]。在低濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，高濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致壞死。相關(guān)報(bào)道[22]顯示，pvl基因的陽(yáng)性率為2%～35% ，本研究中28.75%的陽(yáng)性率接近類似研究的上限。同時(shí)pvl基因表達(dá)水平的提高能增加MRSA的毒性，引起病死率高達(dá)75%的壞死性肺炎[22]。白細(xì)胞毒素LukED通過(guò)形成低聚孔隙樣結(jié)構(gòu)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的死亡。研究[23]表明，LukED基因在不同SA感染類型中的檢出率存在差異，如血流感染中LukED基因的檢出率高于呼吸道感染。本研究中LukED基因在外科感染(44.74%)和血流感染(40.00%)中的檢出率均高于呼吸道感染(0)和其他類型感染(21.74%)。說(shuō)明相比于呼吸道感染和其他類型感染，血流感染和外科感染的SA更容易攜帶LukED基因，可能具有更高的致病性。

綜上所述，不同感染類型SA攜帶多種毒力基因，且對(duì)多種抗菌藥物耐藥。臨床醫(yī)務(wù)人員應(yīng)加強(qiáng)SA的耐藥及毒力動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，合理選擇抗菌藥物，有效控制SA感染流行。同時(shí)本研究也存在一定的局限性，進(jìn)行毒力基因檢測(cè)的菌株數(shù)量少，僅對(duì)SA的耐藥特點(diǎn)、臨床特征及毒力基因的攜帶情況進(jìn)行闡述，對(duì)SA產(chǎn)生高毒力的原因仍不明確，還需結(jié)合流行病學(xué)特征以及毒力調(diào)控系統(tǒng)等方面對(duì)SA致病機(jī)制進(jìn)一步探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。