汪華學(xué)，張 杰，曹云松，徐 陽(yáng)，應(yīng)沖濤，郭 普

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1. 重癥醫(yī)學(xué)科；2. 檢驗(yàn)科，安徽 蚌埠 233004)

近年來(lái)，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbape-nems-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)在臨床的檢出率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，尤其在重癥醫(yī)學(xué)科，CRKP多為泛耐藥菌株，治療藥物選擇困難，且易引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，給臨床診療及醫(yī)院感染防控帶來(lái)巨大的風(fēng)險(xiǎn)與挑戰(zhàn)[1-2]。快速、準(zhǔn)確檢測(cè)CRKP對(duì)臨床重癥感染患者的快速診斷，及時(shí)治療，以及減少醫(yī)院感染風(fēng)險(xiǎn)，減少患者住院費(fèi)用，降低感染患者病死率等具有重要意義。CRKP菌株的檢測(cè)常見(jiàn)方法有耐藥表型檢測(cè)、免疫學(xué)方法檢測(cè)碳青霉烯酶以及分子生物學(xué)方法檢測(cè)碳青霉烯酶基因等[3]，但上述方法存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、試驗(yàn)條件要求高、檢測(cè)費(fèi)用昂貴等不足?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)通過(guò)鑒定微生物的蛋白圖譜，為臨床菌株的快速鑒別提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持[4]。有研究[5-6]表明，MALDI-TOF MS可用于快速鑒別耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)。CRKP最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生由blaKPC、blaIMP、blaNDM-1、blaVIM和blaOXA-48基因等介導(dǎo)的碳青霉烯酶，其中我國(guó)主要的流行株為blaKPC-2型[7]。MALDI-TOF MS快速檢測(cè)CRKP的相關(guān)研究較少，大多應(yīng)用BioTyper軟件進(jìn)行圖譜分析[8]。本研究以PCR方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]，應(yīng)用MALDI-TOF MS和SARAMIS軟件建立耐藥型和敏感型2種超級(jí)圖庫(kù)(Super-Spectra)，用于快速鑒定攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2018年9月—2020年11月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床住院患者分離自痰、血、尿及胸腔積液等標(biāo)本的肺炎克雷伯菌，排除同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 8739、大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA-1705(blaKPC-2陽(yáng)性)、ATCC BAA-1706(blaKPC-2陰性)。菌株均保存于該院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑及儀器 MH平板、哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自合肥天達(dá)試劑公司；MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀、48孔靶板及CHCA基質(zhì)液購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京Tiangen有限公司；美羅培南(10 μg)和亞胺培南(10 μg)藥敏卡片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與種屬鑒定 采用三區(qū)劃線，接種收集的菌株，在(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取單一菌落，應(yīng)用甲酸萃取法[8]進(jìn)行處理，MALDI-TOF MS鑒定菌株，每個(gè)菌株兩個(gè)靶點(diǎn)，圖譜由自帶的RUO系統(tǒng)比對(duì)獲取。

1.2.2 耐藥表型檢測(cè) 采用K-B法檢測(cè)菌株耐藥性，結(jié)果參照2020版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) M100 30th藥敏標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2.3 耐藥基因檢測(cè) 從耐藥表型檢測(cè)獲得的CRKP菌株中，挑取單一菌落，接種于3 mL液體肉湯培養(yǎng)基中，進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)菌液參照說(shuō)明書，應(yīng)用DNA提取試劑盒，從中獲得基因組DNA(OD260/OD280為1.7～1.9)；根據(jù)blaKPC-2基因特異引物(見(jiàn)表1)，對(duì)基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比確認(rèn)。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.4 耐藥型和敏感型超級(jí)圖庫(kù)的建立 選取70株肺炎克雷伯菌，參照1.2.1方法提取檢出blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌菌體蛋白，并進(jìn)行圖譜采集。結(jié)果以置信區(qū)間為衡量標(biāo)準(zhǔn)(置信區(qū)間為75%～99.9%表示結(jié)果可信，<75%表示結(jié)果不可信)。將收集的圖譜保存至一個(gè)文件夾中，去除較大差異的圖譜(確認(rèn)Taxonomy>80%),峰的質(zhì)量(datacount)為80～230；選擇質(zhì)譜峰度相同的最特異的峰，確保每種質(zhì)量峰至少80%的菌株擁有，最終保留35～49個(gè)峰(目標(biāo)39～41)，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定權(quán)重，建立攜帶blaKPC基因型肺炎克雷伯菌的Super-Spectra，用于下一步的驗(yàn)證。碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌(carbapenem-sensitiveKlebsiellapneumoniae, CSKP) Super-Spectra的建立方法同上，激活后用于驗(yàn)證。

1.2.5 Super-Spectra驗(yàn)證 根據(jù)1.2.1的方法，選擇除建庫(kù)以外的肺炎克雷伯菌，利用MALDI-TOF MS收集圖譜，應(yīng)用新建的Super-Spectra驗(yàn)證是否耐藥；以K-B法和PCR結(jié)果作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 耐藥表型及基因型分布 共收集295株肺炎克雷伯菌，經(jīng)耐藥表型篩選CRKP 143株和CSKP 152株；CRKP菌株中檢出攜帶碳青霉烯酶基因140株，經(jīng)測(cè)序鑒定為攜帶blaKPC-2基因134株，攜帶blaKPC-18基因3株，攜帶blaNDM-1基因2株，攜帶blaIMP基因1株，未鑒定出blaOXA-48基因；其中2株同時(shí)檢出blaKPC-2和blaNDM-1基因。質(zhì)控菌株ATCC BAA-1705攜帶blaKPC-2基因。部分菌株P(guān)CR結(jié)果見(jiàn)圖1。

M：2 000 bp DNA Marker；1～6 泳道：CRKP 菌株。

2.2 Super-Spectra結(jié)果

2.2.1 攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的超級(jí)圖庫(kù) 以PCR為標(biāo)準(zhǔn)，選取其中攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌70株，并加入ATCC BAA-1705，共71株CRKP建立Super-Spectra；菌株Taxonomy均>80%，收集最特異的40個(gè)特異峰，確定權(quán)重為28，獲得攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的Super-Spectra，見(jiàn)圖2。

圖2 攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的Super-Spectra圖譜

2.2.2 CSKP的超級(jí)圖庫(kù) 選取CSKP 70株，加入ATCC BAA-1706，共71株，確定權(quán)重為28，建立Super-Spectra，圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 CSKP Super-Spectra圖譜

2.2.3 Super-Spectra比較 設(shè)置error值<0.05，二者的圖譜重合率為80%，見(jiàn)圖4。比較發(fā)現(xiàn)，4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z是攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的特征峰，3 579、10 079.3 m/z是CSKP的特征峰。上述5個(gè)峰可作為區(qū)分?jǐn)y帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的特征峰。

圖4 攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的Super-Spectra對(duì)比圖

2.3 驗(yàn)證結(jié)果 將除建庫(kù)以外的155株肺炎克雷伯菌作為驗(yàn)證菌株，以K-B法和PCR作為參考標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌和CSKP的Super-Spectra圖庫(kù)的準(zhǔn)確性，見(jiàn)表2。攜帶blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌準(zhǔn)確率94.52%(69/73)，CSKP準(zhǔn)確率91.46%(75/82)，新建的Super-Spectra鑒定肺炎克雷伯菌是否對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的準(zhǔn)確率為92.90%(144/155)。

表2 Super-Spectra圖庫(kù)驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

CRKP是醫(yī)院感染的重要致病菌，感染治療困難，患者病死率高，同時(shí)容易在醫(yī)院內(nèi)傳播引起醫(yī)院感染[10]。而檢測(cè)CRKP的傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)，分子檢測(cè)手段靈敏度和特異度高，但是對(duì)試驗(yàn)環(huán)境以及人員要求較高，且價(jià)格昂貴。因此，快速診斷CRKP有利于臨床早期正確選擇抗菌藥物，降低患者病死率，建立一種快速、簡(jiǎn)便且價(jià)格較低的CRKP檢測(cè)方法尤為重要。

MALDI-TOF MS是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于臨床的快速鑒定病原菌的新方法。研究[11-12]顯示MALDI-TOF MS在快速鑒別病原菌的同時(shí)可用于CRKP的檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)菌株與碳青酶烯類抗生素作用一段時(shí)間后的水解產(chǎn)物，或者直接檢測(cè)菌株的碳青霉烯酶質(zhì)譜特征峰來(lái)判斷CRKP。還有研究[13]采用直接靶板微滴生長(zhǎng)法評(píng)估菌株對(duì)碳青酶烯類抗生素的最小抑菌濃度(MIC)值從而鑒別CRKP。其中直接檢測(cè)碳青霉烯酶的質(zhì)譜特征峰最為便捷。MALDI-TOF MS快速鑒定微生物主要是BioTyper和SARAMIS兩種主要系統(tǒng)，其中BioTyper檢測(cè)CRKP的方法多用于科研[11, 14]，需要通過(guò)兩組數(shù)據(jù)的聚類分析和主成分分析，根據(jù)多菌株或多樣本獲得驗(yàn)證結(jié)果，操作繁瑣，易導(dǎo)致容錯(cuò)率降低。而本次研究以鑒定單一菌株為目的，適合臨床某一種菌株或亞種的初篩。本研究通過(guò)初篩出攜帶blaKPC-2肺炎克雷伯菌，作為建立Super-Spectra圖庫(kù)的試驗(yàn)菌株，能夠鑒定大多數(shù)CRKP，可作為臨床第一步快速篩選耐藥菌株的有效手段。通過(guò)采用MALDI-TOF MS RUO系統(tǒng)和SARAMIS軟件，對(duì)攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌和CSKP進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)區(qū)別兩者的特征峰。與常規(guī)鑒定儀相比，通過(guò)質(zhì)譜比對(duì)特征峰，可在5～10 min內(nèi)快速初篩，具有時(shí)間短、高通量、準(zhǔn)確性高、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，并且采用單一菌株，彌補(bǔ)了時(shí)效長(zhǎng)、準(zhǔn)確性低、操作繁瑣等不足，對(duì)疾病診療及感染防控具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)比較攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌和CSKP的超級(jí)圖庫(kù)，發(fā)現(xiàn)4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z是攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌的特征峰，3 579、10 079.3 m/z是CSKP的特征峰，這5個(gè)特征可以作為該院快速篩查肺炎克雷伯菌的有效工具。經(jīng)過(guò)臨床菌株的驗(yàn)證準(zhǔn)確率為92.90%，其中攜帶blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌準(zhǔn)確率為94.52%，CSKP準(zhǔn)確率為91.46%。

研究顯示[9, 15]，不同地區(qū)碳青霉烯酶基因型分布雖有所差異，但是KPC-2型仍是多地區(qū)最常見(jiàn)的碳青霉烯酶。國(guó)外研究[16-17]顯示，攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌的特征峰11 109 m/z，位于編碼PKPQIL-p019蛋白的質(zhì)粒上，但該質(zhì)粒僅在研究區(qū)域內(nèi)流行，在其他不攜帶該質(zhì)粒的區(qū)域內(nèi)尚未檢測(cè)出該特征峰，表明菌株的遺傳背景不同，其特征峰大多不盡相同。該院近3年檢出的CRKP菌株也以攜帶KPC-2基因型為主，其他常見(jiàn)碳青霉烯酶基因型檢出率均較低，產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶作為CRKP菌株的主要耐藥機(jī)制，且種類較為單一。依據(jù)是否存在4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z三個(gè)特征峰，對(duì)于本地區(qū)快速篩選攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)通過(guò)分析特征峰之間的差異，快速篩選耐藥菌株，進(jìn)行溯源性分析，判斷醫(yī)院內(nèi)或者本地區(qū)是否存在暴發(fā)流行，具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在區(qū)域流行病學(xué)研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中有4株肺炎克雷伯菌經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析，未獲得鑒定結(jié)果。耐藥表型分析顯示為2株耐藥和2株敏感，2株耐藥菌株經(jīng)質(zhì)譜分析，未出現(xiàn)4 154.4、8 310.7、10 880.8 m/z特征峰，根據(jù)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2株耐藥菌株同時(shí)攜帶blaKPC-2基因和blaNDM-1基因，兩種基因之間可能存在部分干擾，導(dǎo)致編碼蛋白出現(xiàn)不穩(wěn)定性，干擾菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度；除蛋白表達(dá)水平外，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果受到臨床菌株來(lái)源、抗菌藥物選擇壓力、試驗(yàn)室環(huán)境、操作者操作嫻熟水平及待測(cè)菌株活性等因素制約；菌體可能存在不表達(dá)或表達(dá)過(guò)度，導(dǎo)致SARAMIS軟件分析菌體的準(zhǔn)確性不高。本次驗(yàn)證試驗(yàn)中有2株CRKP，使用質(zhì)譜超級(jí)圖庫(kù)分析，鑒定為CSKP；5株CSKP鑒定為CRKP?？赡苡捎诨虻倪z傳背景不同，使菌株蛋白表達(dá)存在差異，影響驗(yàn)證結(jié)果。本次試驗(yàn)樣本數(shù)量有限，后期需要擴(kuò)大試驗(yàn)菌株，根據(jù)CRKP的耐藥機(jī)制，豐富CRKP的特征峰，提高驗(yàn)證的準(zhǔn)確率。

綜上所述，通過(guò)嚴(yán)格構(gòu)建攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌和CSKP的超級(jí)圖譜庫(kù)，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的初篩方法用于CRKP的鑒定，有助于在區(qū)域流行病學(xué)研究中有效快速鑒定攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌，以降低其流行和暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在后續(xù)研究中，可進(jìn)一步擴(kuò)展該區(qū)域的圖譜庫(kù)，嚴(yán)格遵循要求，盡可能選取更多具有代表性的圖譜，納入攜帶blaKPC-2基因型肺炎克雷伯菌的超級(jí)圖譜庫(kù)中。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。