蔚芳芳 谷鈺峰 周瑾 王靜 崔孝敏 姚文杰

[摘要] 目的 分析磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）在Graves’?。℅D）病人外周血B細(xì)胞中的表達(dá)，并探討其在GD發(fā)生、發(fā)展中可能的機(jī)制。方法 選取診斷明確的GD病人21例作為GD組，同期選取體檢正常的健康人21例作為正常對照組（HC組）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組外周血B細(xì)胞及其亞群PTEN的表達(dá)，并分析GD病人PTEN表達(dá)與促甲狀腺激素（TSH）、游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（Anti-TPO）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）、促甲狀腺素受體抗體（TRAb）等指標(biāo)的相關(guān)性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）方法檢測兩組外周血CD19+B細(xì)胞PTEN mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與HC組相比較，GD組CD19+B細(xì)胞的比例顯著升高，CD19+B細(xì)胞、幼稚性B細(xì)胞（CD19+IgD+CD27-）、未類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞（CD19+IgD+CD27+）、類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞（CD19+IgD-CD27+）、總的記憶細(xì)胞（CD19+CD27+）以及雙陰性B細(xì)胞（CD19+IgD-CD27-）PTEN表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.536～-2.252，P<0.05）。GD組CD19+B細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)較HC組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.763，P<0.05）。相關(guān)性分析顯示，PTEN與TRAb呈正相關(guān)（r=0.490，P<0.05）。結(jié)論 PTEN在GD病人外周血B細(xì)胞中高表達(dá)，可抑制PI3K/AKT信號通路，使磷脂酰肌醇3磷酸 （PIP3）水解為磷脂酰肌醇2磷酸（PIP2）增加，可能通過磷脂酶A2途徑在GD中發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 格雷夫斯病;B-淋巴細(xì)胞;PTEN磷酸水解酶

[中圖分類號] R581.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）01-0100-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.030

Graves’?。℅D）是一種影響甲狀腺的自身免疫性疾病，發(fā)病率為1.0%～1.5%[1]，女性發(fā)病率明顯高于男性[2]。GD的臨床表現(xiàn)主要為甲狀腺功能亢進(jìn)產(chǎn)生的高代謝癥候群，如煩躁、心慌、容易激動(dòng)等，有時(shí)伴有甲狀腺大、脛前黏液水腫以及眼征等[3-4]。有研究認(rèn)為，遺傳和環(huán)境等因素的相互作用使病人B細(xì)胞的活化閾值降低，導(dǎo)致其產(chǎn)生了針對促甲狀腺激素受體（TSHR）的刺激性抗體（TSAb），該抗體是GD的致病性抗體，由B細(xì)胞分泌[5]。B細(xì)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路參與了其功能和穩(wěn)態(tài)性的維持[6-11]。磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）是PI3K/蛋白激酶B（AKT）信號通路的重要負(fù)調(diào)控因子，可拮抗PI3K激酶的功能[12-13]。本實(shí)驗(yàn)主要以GD病人外周血B細(xì)胞為研究對象，通過流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)對B細(xì)胞及其亞群PTEN的表達(dá)進(jìn)行分析，以明確PTEN在GD病人免疫調(diào)節(jié)中的作用，探究其與甲狀腺功能指標(biāo)的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年5月—2020年3月于青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院內(nèi)分泌科診斷明確的GD初發(fā)病人21例（GD組），其中男性6例，女性15例;年齡31～64歲，平均（46.3±10.3）歲。同期選取體檢正常的健康人21例作為正常對照組（HC組），男7例，女14例;年齡29～64歲，平均（45.5±11.9）歲。

對照組病人血清促甲狀腺激素（TSH）水平正常，無甲狀腺大、無甲狀腺疾病及家族史。兩組受檢者的性別和年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 試劑和儀器

人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司）;流式熒光標(biāo)記抗體及其同型對照、溶血素、破膜液Perm/Wash和固定液Cytofix/Cytoperm（美國BD公司）;RNA提取用Trizol（美國Ambion公司生產(chǎn)）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit（賽默飛世爾科技公司）;RT-PCR試劑盒Power SYBR Green PCR Master Mix（美國生命技術(shù)公司）;RNAase Free water（天根生化科技有限公司）。FACSAriaⅢ流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）;RT-PCR儀（美國伯樂公司）。甲狀腺功能檢測儀器Cobas E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其試劑（羅氏診斷有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集及外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離 采取受檢者早晨空腹靜脈全血標(biāo)本，EDTA抗凝，顛倒混勻后轉(zhuǎn)入無菌離心管中，2 000 r/min離心10 min，吸出血漿保存，血細(xì)胞用1×PBS按照1∶1稀釋，并充分混勻;將人外周血淋巴細(xì)胞分離液12.5 mL加入到50 mL PBMC無菌管，離心待用;將混勻稀釋后的血液用移液器緩慢貼壁加入到離心好的淋巴細(xì)胞分離液液面上，保持界面清晰，離心管隔斷以上為血細(xì)胞，隔斷以下為淋巴細(xì)胞分離液;25 ℃、2 000 r/min離心25 min，不設(shè)置剎車制動(dòng);離心后，離心管內(nèi)液體分為3層，上層和中間層之間為以PBMC為主的白色不透明帶，小心吸取白色不透明帶細(xì)胞至無菌離心管中;加5倍以上的PBS，4 ℃、1 632 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞2次。

1.3.2 甲狀腺功能檢測 應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法，分別檢測受檢者血清標(biāo)本TSH、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（Anti-TPO）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）和促甲狀腺素受體抗體（TRAb）水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 外周血CD19+B細(xì)胞的比例及其各亞群PTEN表達(dá)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。將上述分離出的PBMC定容，每個(gè)樣品管大約106個(gè)細(xì)胞，剩余細(xì)胞加入APC-CY7 anti-human CD19，用于分選B細(xì)胞。樣品管依次加入APC-CY7 anti-human CD19、PE anti-human IgD、Percp-cy5.5、anti-human CD38、PE-CY7 anti-human CD27抗體各5 μL，渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min;加入PBS 1 mL，4 ℃、1 632 r/min離心5 min，棄去上清，重復(fù)2次。將各樣品管分別加入250 μL Cytofix/Cytoperm，渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min;加入1×BD Perm/Wash 500 μL，1 632 r/min離心5 min，棄去上清，重復(fù)2次;然后加入100 μL BD Perm/Wash和20 μL APC Mouse anti-human PTEN，渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min;加入1×BD Perm/Wash 500 μL，1 632 r/min離心5 min，棄去上清，重復(fù)2次;將上述各管加入500 μL Cell Staining Buffer，用流式細(xì)胞分析儀上機(jī)檢測、分選。根據(jù)CD19、IgD、CD27、CD38染色情況，將B細(xì)胞分為幼稚性B細(xì)胞（CD19+IgD+CD27-）、未類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞（CD19+IgD+CD27+）、類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞（CD19+IgD-CD27+）、總的記憶細(xì)胞（CD19+CD27+）、漿母細(xì)胞（CD19+IgD-CD38+CD27+）、過渡性B細(xì)胞（CD19 + IgDdim CD38+）及雙陰性B細(xì)胞（CD19+IgD-CD27-）[14]。

1.3.4 外周血CD19+B細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR方法檢測。將外周血分選出的CD19+B細(xì)胞用Trizol法提取RNA，應(yīng)用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ，調(diào)整cDNA濃度，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系50 μL，內(nèi)含：cDNA 模板4 μL，SYBR Green 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL， RNAase Free water 19 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min， 95 ℃、15 s， 60 ℃、1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。計(jì)數(shù)達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)（CT值），采用2-ΔΔCt值表示PTEN mRNA的相對表達(dá)量。PTEN和GAPDH基因（內(nèi)參照）引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先通過Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)或Shapira-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料結(jié)果以P50（P25～P75）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用秩相關(guān)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血CD19+B細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比比較

HC組、GD組病人外周血CD19+B細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比分別為5.80（4.05～9.85）%、12.70（6.65～21.55）%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z=-3.006，P<0.05）。

2.2 兩組外周血CD19+B細(xì)胞及其亞群PTEN表達(dá)比較

HC組和GD組外周血B細(xì)胞及其亞群上均有PTEN表達(dá)，以漿母細(xì)胞和過渡性B細(xì)胞上PTEN的熒光強(qiáng)度最高。與HC組相比，GD組CD19+B細(xì)胞、幼稚性B細(xì)胞、未類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞、類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞、總的記憶細(xì)胞以及雙陰性B細(xì)胞PTEN表達(dá)均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.536～-2.252，P<0.05）;兩組漿母細(xì)胞和過渡性B細(xì)胞PTEN表達(dá)的差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.3 兩組外周血CD19+B細(xì)胞PTEN mRNA表達(dá)比較

HC組、GD組外周血CD19+B細(xì)胞的PTEN mRNA表達(dá)分別為0.527（0.325～1.438）、2.638（0.789～3.544），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.763，P<0.05）。

2.4 GD組CD19+B 細(xì)胞PTEN的表達(dá)與甲狀腺功能指標(biāo)的相關(guān)性

秩相關(guān)分析顯示，GD組CD19+B 細(xì)胞PTEN與FT4、FT3、Anti-TPO、TGAb水平均無相關(guān)性（r=-0.240～0.019，P>0.05），與TRAb呈正相關(guān)（r=0.490，P<0.05）。見圖1。

3 討 論

產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞是GD發(fā)病機(jī)制的重要貢獻(xiàn)者，在機(jī)體的體液免疫中B細(xì)胞發(fā)揮作用的途徑有多種，常見的主要有提呈抗原、分泌抗體、產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥因子等;B細(xì)胞還可以調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的生長、分化和分泌，與自身免疫性GD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。B細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化或者功能出現(xiàn)異常對自身免疫性疾病來說都是非常有研究意義的。有研究表明，自身抗體參與了GD的發(fā)生發(fā)展，在病程中還發(fā)現(xiàn)了器官特異性的免疫損傷[15]。梁金明等[16]對GD不同發(fā)展過程中CD19+B細(xì)胞含量的變化研究顯示，初發(fā)組CD19+B細(xì)胞含量明顯高于HC組，本研究結(jié)果與其一致。因此，初步推測GD病人外周血中增加的B細(xì)胞是導(dǎo)致體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)的基礎(chǔ)，可以促進(jìn)GD的發(fā)生。

GD的發(fā)病機(jī)制與病人血清中存在的TSHR抗體有密切關(guān)系。TRAb是一種非常關(guān)鍵的致病因子，該抗體由B淋巴細(xì)胞分泌，在GD病人中的檢出率高達(dá)80%～100%，TRAb與TSH競爭結(jié)合到甲狀腺細(xì)胞膜表面的TSHR，進(jìn)而激活TSH受體，通過3條途徑促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞分裂、增殖，從而使病人產(chǎn)生類似于甲狀腺功能亢進(jìn)的臨床癥狀，導(dǎo)致GD的發(fā)生[17-18]。①環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/腺苷酸環(huán)化酶（AC）級聯(lián)反應(yīng)：TRAb與TSH受體結(jié)合后借助G蛋白的偶聯(lián)作用來激活A(yù)C，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平受到AC調(diào)節(jié)后引起反應(yīng)[19-20];②磷酸肌醇-Ca2+級聯(lián)反應(yīng)：TRAb與TSH受體結(jié)合后可以激活磷脂-Ca2+，引起三磷酸肌醇（IP3）增加伴隨著細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員增加，Ca2+發(fā)揮第二信使的作用導(dǎo)致甲狀腺功能發(fā)生變化，這些變化包括甲狀腺球蛋白的碘化、碘的有機(jī)化、甲狀腺素的合成[21];③磷脂酶A2途徑：通過該途徑PIP2被磷脂酶C激活水解生成二?；视团cIP3，生成的兩種產(chǎn)物均可作為第二信使來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[22]。

B細(xì)胞的調(diào)控需要許多種信號通路，其中非常重要的一條就是PI3K/AKT信號通路，PTEN是該信號通路的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，能將激活的PIP3重新水解成為PIP2。本文研究結(jié)果顯示，PTEN在外周血B細(xì)胞及其亞群中均有表達(dá)，GD病人CD19+B細(xì)胞以及幼稚性B細(xì)胞、未類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞、類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞、總的記憶細(xì)胞和雙陰性B細(xì)胞PTEN表達(dá)均明顯高于HC組。在這些B細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)的PTEN使PIP3重新水解為PIP2，進(jìn)而通過磷脂酶A2途徑發(fā)揮作用，而該途徑產(chǎn)生的PIP2的水解產(chǎn)物IP3又可以啟動(dòng)磷酸肌醇-Ca2+級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮作用，因此GD病人外周血B細(xì)胞內(nèi)PTEN升高可能通過磷酸肌醇-Ca2+級聯(lián)反應(yīng)和磷脂酶A2途徑使TRAb發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞的功能和生長，觸發(fā)GD的發(fā)生，其詳細(xì)的致病機(jī)制還需要更深一步的研究。

本文相關(guān)性分析顯示，GD病人體內(nèi)CD19+B細(xì)胞升高，其PTEN表達(dá)與TRAb呈正相關(guān)。有研究顯示，GD病人TRAb產(chǎn)生量的多少與甲狀腺體積的大小呈正相關(guān)[23];GD病人血清中的TRAb滴度與GD的病程有密切關(guān)系[24]，由此推測CD19+B細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)可能成為GD診斷的輔助指標(biāo)。B淋巴細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中占比較少，通過流式細(xì)胞術(shù)分選B細(xì)胞來進(jìn)行RT-PCR檢測需要大量的血液，由于實(shí)驗(yàn)條件局限性，本文僅應(yīng)用RT-PCR方法研究了CD19+B細(xì)胞內(nèi)PTEN mRNA表達(dá)水平，未對各亞群的PTEN mRNA表達(dá)進(jìn)行研究。

綜上所述，PTEN在GD病人B細(xì)胞中高表達(dá)，通過多種途徑參與GD的發(fā)生、發(fā)展;CD19+B細(xì)胞內(nèi)的PTEN表達(dá)與TRAb呈正相關(guān)，為GD的輔助診斷和治療開辟了新途徑。由于本研究樣本量有限，本文結(jié)論還需要更大的樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

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