馬 樂,呂冬梅,韓 佳*

0 引言

血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率在兒童疾病中位居前列，化療時由于兒童生理機能尚未成熟，對大劑量藥物的耐受性較差，常因諸多毒副作用影響疾病的治療。大劑量甲氨蝶呤(High-dose methotrexate，HD-MTX)是兒童血液腫瘤治療的一線藥物，能夠通過競爭性抑制二氫葉酸還原酶的活性抑制腫瘤細胞的增殖，顯著提高癌癥患者的長期生存率[1-2]。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)可以抑制幾乎所有分裂增殖比高的細胞，不良反應發(fā)生率較高，其中骨髓抑制較為常見。骨髓抑制又稱血液學毒性，一般發(fā)生于化療后的第5～7天[3]，主要表現(xiàn)為白細胞、血小板、中性粒細胞及血紅蛋白減少，嚴重者易并發(fā)全身感染，影響化療周期甚至致死?；颊邔TX血液學毒性反應的發(fā)生率和嚴重程度往往存在較大的個體差異，隨著藥物基因組學的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，藥物代謝酶與轉運體基因位點的雜合與純合突變均可能引起編碼的酶失活或者活性增強，進而引起不良反應的個體差異。有研究報道，這種個體差異與亞甲基四氫葉酸還原酶 (Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和ATP結合盒B亞家族成員1轉運蛋白(Adenosine triphosphate-binding cassette，subfamily B，member 1 gene，ABCB1)基因多態(tài)性之間可能存在關聯(lián)性[4-7]。MTHFR能夠參與葉酸代謝、DNA的合成和甲基化，與MTX藥理作用的發(fā)揮密切相關。編碼MTHFR的基因發(fā)生不同種類的突變可能導致氨基酸功能的改變，使DNA的合成和修復受到影響。目前關于MTHFR的不同單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與藥物代謝相關性研究最多的位點是MTHFR C677T。當MTHFR第677位密碼子發(fā)生了C(胞嘧啶)/T(胸腺嘧啶)突變時，其酶活性發(fā)生改變，繼而使葉酸的正常功能受到影響，MTX的藥效和不良反應也可能發(fā)生改變[8-9]。ABCB1又稱多藥耐藥基因(Multidrug resistance-1，MDR1)，能夠編碼介導內源性物質和藥物的向外釋放的P-糖蛋白，P-糖蛋白與疏水性化療藥物有結合作用，并能夠借助ATP以主動轉運的方式將藥物泵出細胞。有報道ABCB1 C3435T是最可能與P-糖蛋白的表達與功能有關的位點(ABCB1 C3435T)[10]。ABCB1 C3435T的3種亞型編碼的P-糖蛋白呈不同的表達狀態(tài)時，可能引起藥物療效和毒性的差異[11]。因此，本研究探討血液腫瘤患兒應用HD-MTX化療后骨髓抑制與MTHFR C677T(rs1801133)和ABCB1 C3435T(rs1045642)基因多態(tài)性的相關性，從基因水平判斷化療后的骨髓抑制程度，為治療提供有意義的參考，從而提高患兒的生存質量。

1 資料和方法

1.1 研究對象 納入2019-2020年在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院住院且應用HD-MTX (>500 mg/m2)治療的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患兒共94例，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人知情同意。

入選標準：①1～17歲;②確診為血液系統(tǒng)惡性腫瘤(包括急性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等)；③采用大劑量甲氨蝶呤注射液治療，且化療中未出現(xiàn)嚴重過敏反應；④使用HD-MTX前及用藥后給予充分水化及堿化尿液。排除標準：①化療前查血常規(guī)及肝腎功能，生化指標在正常范圍內；②治療方案中合并使用其他可引起骨髓抑制的藥物。收集并整理患者的基本信息、給藥劑量、合并用藥情況、MTX血藥濃度以及用藥期間產(chǎn)生的不良反應等。

1.2 方法

1.2.1 給藥劑量與方法 MTX總劑量為2～5 g/m2，將給藥量的1/10(不超過500 mg)作為突擊量于30 min內快速靜脈滴入，余量在23.5 h內勻速滴入。MTX治療前、治療后3 d口服碳酸氫鈉，堿化尿液使尿液pH≥7。滴注MTX當日以及其后3 d給予患兒充分水化，用酶放大免疫法在用藥后24 h、48 h、72 h分別測定MTX血藥濃度。于滴注MTX 后42 h靜注15 mg/m2的亞葉酸鈣解救，每6小時1次，密切觀察患兒反應，根據(jù)MTX血藥濃度調整次數(shù)及劑量，至濃度≤0.1 μmol/L。

1.2.2 基因型檢測方法 使用核酸提取及純化試劑(上海百傲科技有限公司)從患者全血中提取DNA，置于-20 ℃冰箱內保存。使用PCR擴增試劑盒(上海生工生物工程有限公司)配制50 μl的擴增體系置于PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)內完成擴增。引物(由上海生工合成)序列見表1。PCR擴增程序：MTHFR C677T(rs1801133)：①預變性95 ℃，5 min。②30個循環(huán)，變性95 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，40 s。③終延伸72 ℃，7 min，結束后于4 ℃保存。ABCB1 C3435T(rs1045642)：①預變性95 ℃，5 min。②30個循環(huán)，變性95 ℃，30 s；退火57.1 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s。③終延伸72 ℃，5 min，于4 ℃保存。擴增結束后用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行特異性驗證。剩余PCR產(chǎn)物原液送至上海生工測序，將測序結果用CHOMAS軟件與MTHFR和ABCB1基因SNP位點的標準序列比照，以確定患者基因型。

表1 MTHFR與ABCB1基因PCR引物信息

1.2.3 骨髓抑制評價標準 化療過程的毒性反應判定參照世界衛(wèi)生組織推薦的化療藥物毒副反應分級標準，將骨髓抑制(血液學毒性)分為0級、Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級與Ⅳ級，見表2。因Ⅲ級和Ⅳ級毒性反應可對臨床治療產(chǎn)生直接影響，故將Ⅲ級以上骨髓抑制與基因分型結果進行分析。

表2 化療后骨髓抑制分級標準

2 結果

2.1 一般資料 本研究納入94例患兒，男55例，女39例，年齡1～17歲，平均年齡為(7.42±4.27)歲，體重(27.08±12.92)kg，BMI為(16.97±3.14)kg/m2。

2.2 基因型與骨髓抑制程度的分布 采用PCR-直接測序法測定MTHFR C677T與ABCB1 C3435T位點基因型，如圖1和圖2所示，箭頭所指為變異堿基。94例患兒中，MTHFR C677T位點CC型患兒25例(26.60%)，CT型42例(44.68%)，TT型27例(28.72%)；ABCB1 C3435T位點CC型患兒43例(45.74%)，CT型34例(36.17%)，TT型17例(18.09%)?；熀?，患兒出現(xiàn)Ⅰ級骨髓抑制11例(11.70%)，Ⅱ級38例(40.43%)，Ⅲ級31例(32.98%)，Ⅳ級14例(14.89%)，共有45例(47.87%)患兒發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制，各位點基因型與骨髓抑制嚴重程度的分布情況見表3。

圖1 MTHFR C677T位點基因分型波形圖

圖2 ABCB1 C3435T位點分型波形圖

表3 基因型與骨髓抑制程度的分布[例(%)]

2.3 基因多態(tài)性與MTX骨髓抑制的相關性 將患者按骨髓抑制嚴重程度分級分為輕度組(0～Ⅱ級)和嚴重組(Ⅲ級以上)。在MTHFR C677T位點和ABCB1 C3435T位點中，均是CC型為野生純合型，CT型為突變雜合型，TT型為突變純合型。兩位點的純合子CC型攜帶者發(fā)生MTX化療后，嚴重骨髓抑制的比率均低于其他亞型；MTHFR C677T CT型患兒發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制的風險是CC型的3.125倍(95%CI：1.102～8.859，P=0.029)，該位點野生型攜帶者發(fā)生MTX嚴重骨髓抑制的比率低于突變雜合型，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ABCB1 C3435T TT型患兒發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制的風險是CC型的3.422倍(95%CI：1.056～11.092，P=0.036)，ABCB1 C3435T位點含有T等位基因的(CT+TT)患兒發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制的風險是CC型的2.667倍(95%CI：1.152～6.117 2，P=0.021)，該位點野生型攜帶者發(fā)生MTX嚴重骨髓抑制的比率顯著低于突變純合型和至少攜帶1個T等位基因的患兒(P<0.05)，見表4。

表4 基因多態(tài)性與MTX骨髓抑制的相關性[例(%)]

3 討論

MTX是一種抗葉酸類抗腫瘤藥，在HD-MTX臨床應用于血液腫瘤的過程中，由于藥物選擇性較差，患者化療后常會出現(xiàn)不同程度的不良反應，導致用藥劑量減少或治療停止[12]。隨著遺傳藥理學的進展，大量研究顯示，基因多態(tài)性可能是導致藥物療效和不良反應個體差異的相關因素之一。

MTHFR是參與DNA合成和甲基化的一個重要的限速酶，影響核酸代謝過程，MTX的藥物反應與MTHFR催化還原的5,10-亞甲基四氫葉酸的濃度正相關。有Meta分析結果顯示，MTHFR C677T位點T等位基因增加了患者發(fā)生MTX骨髓抑制的風險，該位點與MTX的血液學毒性相關[13-14]。有報道顯示，在發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制的骨肉瘤患者中，TT型的頻率顯著高于CT型和CC型[15]。李靜等[16]對98例接受HD-MTX化療的急性淋巴細胞白血病患者的研究顯示，MTHFR C677T各基因型間Ⅱ級以上骨髓抑制的發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義。Choi等[17]的研究顯示，MTHFR C677T可能成為與MTX相關骨髓抑制的獨立預測指標，與Eissa等[18]的研究結果一致。另有一項關于74例急性淋巴細胞白血病患兒的研究報道，MTHFR C677T 位點TT基因型與MTX血液學毒性顯著相關[19]。本文的研究結果顯示，MTHFR C677T位點為CT型的患者發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制的比率顯著高于CC型，可能對MTX化療后骨髓抑制存在一定程度的預測價值。

ABCB1主要位于細胞膜上，可以以主動轉運的形式將藥物泵出細胞，降低胞內藥物濃度并減輕藥物對細胞的毒性作用。由ABCB1編碼的P-糖蛋白能夠影響藥物在機體內的吸收、分布和排泄。有報道ABCB1 C3435T不同基因型患者細胞中P-糖蛋白活性的差異可能對使用P-糖蛋白運輸?shù)目拱┧幬锏幕煼磻a(chǎn)生影響[20]。楊琳等[21]納入81例使用HD-MTX化療的非霍奇金淋巴瘤患者的研究中，至少含1個T等位基因(CT+TT)患者發(fā)生2級以上血小板減少的比率顯著高于CC患者，與潘騁[22]的結果一致。另有一項針對墨西哥急性淋巴細胞白血病患兒的研究顯示，該位點CC純合型攜帶者發(fā)生白細胞減少的風險更低[23]。本研究中，隨著ABCB1 C3435T位點的基因型含等位基因T的數(shù)量上升，發(fā)生Ⅲ級以上骨髓抑制的比率也逐步上升，CC型患兒發(fā)生嚴重骨髓抑制的比率顯著低于 (CT+TT)型的患兒，和上述研究結果相同。

綜上所述，檢測MTHFR C677T和ABCB1 C3435T位點基因型對預測MTX相關骨髓抑制程度可能有潛在的臨床價值。此外，目前關于藥物代謝酶和轉運體基因多態(tài)性對MTX療效與毒性影響的研究幾乎都僅限于固定的某一種族和疾病，而治療方案和患者群體等方面的變化都可能會影響基因多態(tài)性與治療結果間的關系[24-25]。因此，在未來的研究中仍需要大規(guī)模和多中心的實驗，基因多態(tài)性對骨髓抑制嚴重程度的具體影響機制也有待進一步探索，為依據(jù)藥物基因組學設計個體化給藥方案、減少患者嚴重不良反應奠定基礎。