郝 軍，?；w，盛 旻，楊春艷，邢娟麗

0 引言

頸性眩暈(Cervical vertigo，CV)指因頸椎部位組織結構障礙而引起的眩暈，占眩暈的65%[1]。近年來，CV的發(fā)生率明顯升高，而且呈現(xiàn)年輕化發(fā)展[2]，其診斷和治療仍有明顯難度，需要深入研究CV的發(fā)病機制并探究良好的治療策略[3]。

多種中藥在CV治療中表現(xiàn)出良好的效果[4]，其中劉俊逸[5]應用刺五加(Acanthopanax senticosus)注射液改善了CV患者的神經(jīng)壓迫，促進了血液循環(huán)以及腦部供血，治療有效率達到93.3%，然而，刺五加緩解或治療CV的內在機制仍不清楚。研究表明，刺五加通過調節(jié)多巴胺D2受體(Dopamine Receptor D2，DRD2)和小膠質細胞M1(促炎)/M2(抗炎)極性類型對血管收縮/舒張和神經(jīng)損傷發(fā)揮改善作用，并對機體具有鎮(zhèn)痛效果[6-8]。然而，刺五加治療對CV患者體內DRD2表達以及小膠質細胞的M1/M2極性的影響仍不清楚。本研究納入經(jīng)刺五加注射液癥狀緩解的CV患者和未進行治療的CV患者，檢測血液中DRD2的表達和DRD2基因CpG島甲基化改變，并在體外培養(yǎng)人小膠質細胞hmc-3，探討刺五加注射液對其M1/M2極性的調節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 基本資料 納入我院30例確診的CV患者(CV組，未行刺五加治療)以及同期經(jīng)過刺五加治療后臨床療效評級為顯效的30例CV患者(治療組)，此外，招募30例健康對照受試者(健康組)。

CV組納入標準：①主訴眩暈；②經(jīng)影像學檢驗并經(jīng)2位醫(yī)生診斷為椎動脈頸椎病；③三磷腺苷、10%葡萄糖注射液、維生素B6、輔酶A 100 U進行常規(guī)治療[5]。治療組納入標準：①與CV組納入標準一致；②以三磷腺苷、10%葡萄糖注射液、維生素B6、輔酶A 100 U治療，刺五加注射液50 ml靜脈滴注1個療程；③臨床治療效果評為顯效，即患者感覺不到有眩暈的癥狀。

排除標準：①既往精神病史和藥物治療；②有血緣關系的患者；③非頸椎結果異常的其他因素引起的眩暈患者。

1.2 方法

1.2.1 試劑與耗材 人小膠質細胞hmc-3購于武漢普諾賽生命科技有限公司；EDTA管購于上海新睿生物科技有限公司；QIAcube全自動核酸純化系統(tǒng)全自動核酸提取工作站購于德國QIAcube公司；EpiTect Plus DNA亞硫酸氫鹽試劑盒購于美國Qiagen公司；PyroMark Q24 Advanced試劑盒購于上海研卉生物科技有限公司。細胞計數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)購于上海碧云天公司。酶標儀FC購于美國賽默飛世爾公司。RNA提取試劑盒、Power SYBR Green及高容量cDNA反轉錄試劑盒均購于大連Takara公司。RIPA蛋白提取試劑盒購于美國Sigma-Aldrich公司。DRD2、CD16、CD32、CD86、Arginase1、CD206、GAPDH的第一抗體均購于美國Abcam公司。Alexa染料購于美國Invitrogen公司。DAPI購于美國Life Technologies公司。AmpliTaq gold試劑盒購于美國賽默飛公司。

1.2.2 血樣收集 采用EDTA管收集靜脈血。從全外周血白細胞中提取基因組DNA。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用QIAcube全自動核酸純化系統(tǒng)全自動核酸提取工作站提取基因組DNA。于4 ℃保存純化的基因組DNA。

1.2.3 RT-qPCR 使用總RNA提取試劑盒抽提外周血總RNA或者小膠質細胞的總RNA。使用高容量cDNA反轉錄試劑盒，用隨機引物合成第一鏈cDNA，隨后使用Power SYBR Green在CFX96-Bio Rad實時PCR檢測系統(tǒng)上進行qPCR。使用GAPDH作為內參基因?；蛞锶绫?。

表1 RT-qPCR引物序列

亞硫酸氫鹽轉換：根據(jù)生產(chǎn)商的說明嚴格使用EpiTect Plus DNA亞硫酸氫鹽試劑盒對基因組DNA(各1 000 ng)進行亞硫酸氫鹽轉換。并按照試劑盒的協(xié)議對轉換后的基因組DNA進行純化。

1.2.4 PCR擴增與甲基化率檢測 PCR擴增：檢測的CpG-1至CpG-7位點的甲基化[9]，對CpG位點進行擴增。每個PCR樣品的最終反應體積為40 μl，每個反應均包含3.5 μl亞硫酸氫鹽-修飾的全基因組DNA、0.2 mM dNTPs、10×PCR緩沖液、0.5 U的AmpliTaq gold，以及0.2 μM正向和反向引物。循環(huán)條件：變性10 min，45個變性循環(huán)，95 ℃下變性30 s，60 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸1 min，最后在72 ℃延伸 10 min。

甲基化率檢測：分析7個CpG位點的甲基化率。使用PyroMark Q24 Advanced試劑盒對PCR產(chǎn)物進行測序。測序引物：5′-AGTTTTTAAAGGAGAAGATT-3′(CpG-1至CpG-7)，從而分析每個CpG甲基化率。隨后，使用PyroMark Q24 Advanced軟件對各組甲基化率進行定量。

1.2.5 小膠質細胞培養(yǎng) 使用DMEM/F12培養(yǎng)基小膠質細胞hmc-3，DMEM/F12中補充10%FBS和L-谷氨酰胺。培養(yǎng)于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，細胞2 d換液1次。使用刺五加注射液處理小膠質細胞。分別使用20 μg、40 μg、80 μg的刺五加注射液處理細胞24 h[10]。收集細胞并進行后續(xù)實驗。

1.2.6 CCK-8實驗 使用CCK-8測定hmc-3細胞存活率，嚴格按照生產(chǎn)商提供的說明書，使用酶標儀FC在450 nm處測定細胞存活率。

1.2.7 蛋白質印跡 用RIPA緩沖液提取細胞總蛋白，并用BCA測定法進行定量。蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離并使用NC膜進行轉印，對膜使用一抗孵育過夜，隨后使用二抗孵育4 h。使用化學發(fā)光法對膜進行顯色。使用Image Lab軟件通過光密度測定法定量蛋白條帶灰度強度。實驗重復3次。

1.2.8 細胞免疫熒光 免疫熒光標記細胞中DRD2蛋白的表達，將小膠質細胞用4%多聚甲醛固定10 min，使用封閉液(50 mmol/L Tris緩沖液，含20%驢血清和0.3%Triton-X)孵育1 h。將DRD2一抗(1∶300)在4 ℃下孵育過夜：洗滌切片并在室溫下與綠色熒光Alexa染料偶聯(lián)的二抗孵育4 h。在Tris緩沖鹽水中洗滌并用DAPI對細胞核進行復染后，將蓋玻片裝在載玻片上。使用共焦激光顯微鏡獲取圖像。使用ImageJ軟件對共聚焦圖像DRD2陽性細胞進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，并使用Shapiro-Wilk檢驗進行正態(tài)性檢驗。甲基化率遵循正態(tài)分布。用單因素方差分析比較健康組、CV組和治療組DRD2的表達、DRD2每個CpG的甲基化率，并檢測對照組和刺五加組小膠質細胞的DRD2表達和M1/M2表型變化。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 刺五加治療對CV患者DRD2基因表達的影響 首先檢測CV組和健康組外周血中DRD2基因的mRNA表達水平，結果如圖1顯示，與健康組比較，CV組的DRD2 mRNA表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CV組比較，治療組外周血中DRD2基因的mRNA表達上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 刺五加對CV患者體內DRD2基因mRNA水平的影響

2.2 刺五加治療對CV患者DRD2基因甲基化率的影響 圖2A顯示所分析的DRD2啟動子區(qū)域的位置。甲基化比較結果如圖2B，檢測30個CV組樣本和30個健康組樣本中DRD2基因的7個CpG位點的甲基化率，其中CpG-2(14.1±2.6vs.12.6±2.7，P=0.001)，CpG-4 (27.6±4.1vs.25.4±4.2，P=0.003)，CpG-5 (8.6±1.9vs.7.9±1.7，P=0.002)，CpG-6 (11.2±1.8vs.10.0±2.4，P=0.001)，CpG-7 (12.1±2.3vs.11.4± 3.0，P=0.002)。CV組的CpG-1～CpG-7的甲基化率平均值(14.2±1.9)均高于健康組(13.3±2.2)，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。如圖2C所示，刺五加治療對DRD2基因甲基化有影響，治療組的CpG-1～CpG-7的甲基化率(12.5±1.5)平均值低于CV組(14.7±1.8)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。

圖2 刺五加對DRD2基因不同CpG位點甲基化率的影響

2.3 刺五加對小膠質細胞增殖率的影響 刺五加注射液體外處理小膠質細胞，觀察刺五加對小膠質細胞增殖率的影響。如圖3，與對照組比較，20 μg刺五加組的增殖率變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。40 μg刺五加組小膠質細胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.041)。80 μg刺五加組增殖率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。

圖3 通過CCK-8實驗檢測不同濃度的刺五加注射液對小膠質細胞hmc-3增殖率的影響

2.4 刺五加對小膠質細胞DRD2基因表達的影響 見圖4A、4B。與對照組比較，20 μg刺五加組中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表達水平變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。40 μg刺五加組中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表達水平上調，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。80 μg刺五加組中DRD2基因的mRNA水平和蛋白表達水平上調，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。如圖4C，使用免疫熒光法檢測DRD2在小膠質細胞中的表達，結果與蛋白免疫印跡法一致。由于80 μg刺五加對小膠質細胞的增殖率和DRD2有明顯的增加作用，因此選擇80 μg進行后續(xù)研究。

圖4 RT-qPCR、蛋白免疫印跡實驗及細胞免疫熒光法分別檢測刺五加注射液對小膠質細胞DRD2 mRNA(A)和蛋白水平(B/C)的影響

2.5 刺五加對小膠質細胞DRD2甲基化率的影響 在小膠質細胞中，刺五加組的CpG-1至CpG-7的甲基化率(12.63±3.8)低于對照組(14.69±2.8)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖5。

圖5 刺五加對小膠質細胞中DRD2基因不同CpG位點甲基化率的影響

2.6 刺五加對小膠質細胞M1/M2極性的影響 使用RT-qPCR檢測對照組和刺五加組中M1表型CD16、CD32、CD86和M2表型Arginase 1、CD206的mRNA水平。結果顯示，與對照組比較，刺五加組中M1表型CD16、CD32、CD86的表達下調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，而Arginase 1、CD206的mRNA表達上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖6A。

圖6 刺五加對小膠質細胞M1/M2極化標志物的mRNA(A)和蛋白(B)水平的影響

使用蛋白免疫印跡法檢測小膠質細胞M1/M2極化標志物的蛋白水平，其中與對照組比較，CD16、CD32、CD86的表達下調，而Arginase1、CD206表達上調，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見圖6C。

3 討論

本研究以CV患者的臨床血液樣本為基礎，通過檢測刺五加對體內DRD2甲基化率變化以及刺五加對小膠質細胞的極性影響，探討了刺五加對CV治療的內在機制。本研究結果表明，刺五加可能通過抑制CV患者DRD2的CpG位點甲基化促進DRD2表達，此外,刺五加可以正向調節(jié)小膠質細胞的M2型極化特征，為探明刺五加治療CV疾病的內在機制提供部分證據(jù)。

CV是一種源于頸椎病變引起腦供血不足導致的頭暈、頭痛、頸部疼痛為特征的疾病[11]。近年來，CV的發(fā)病率持續(xù)升高，發(fā)病人群明顯趨向于青年，對患者的生活質量造成嚴重影響[12]，然而,CV存在誤診率高，且缺乏有效的診斷和治療策略。目前存在4種假說從不同方面解釋CV，包括本體感受性頸性眩暈、Barré-Lieou綜合征、椎動脈旋轉性眩暈、偏頭痛相關性CV[13]。機制研究表明，頸椎退變是導致頸部結構改變的關鍵因素，并引起頸部神經(jīng)壓迫、頸性疼痛合并肌張力障礙[13]。臨床研究報道，刺五加注射液對CV的臨床癥狀具有緩解作用，主要是通過放松過度緊張的頸部肌肉、通過頸神經(jīng)減壓、改善血液循環(huán)、緩解疼痛等方式從而達到緩解癥狀的作用[5]。本研究中納入的30例刺五加治療后療效為顯效的患者，其體內DRD2基因CpG位點甲基化和表達有改變，并且我們在體外水平同樣驗證了刺五加對DRD2甲基化和表達的影響，這表明DRD2甲基化可能是刺五加調節(jié)CV的機制之一。

研究表明，刺五加提取物通過調節(jié)帕金森病小鼠的多巴胺受體從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[6]。多巴胺是內源性兒茶酚胺類物質，直接通過調節(jié)多巴胺受體調控血管的收縮[14]。DRD2與腦、腎、腸系膜血管的舒張均有關[15]。研究表明，DRD2在肌張力異常及神經(jīng)損傷導致的疼痛中發(fā)揮重要作用[16]。而且在偏頭痛的研究中同樣發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者的DRD2存在高度敏感性。既往對DRD2與炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的研究較多。Del Zompo等[17]研究表明，DRD2在不同類型的偏頭痛中的表達模式不同，甚至具有保護作用[18]。表觀遺傳學改變是提高疾病診斷效率的關鍵，本研究納入經(jīng)刺五加注射液治療后顯效的CV患者和未進行治療的CV患者，檢測了血液中DRD2的表達和甲基化改變，從體內和體外均觀察到刺五加對DRD2 CpG位點甲基化的負調節(jié)和對表達的正向調節(jié)。我們在體外通過免疫熒光法直接觀察到80 μg刺五加上調DRD2表達的結果。因此，以上證據(jù)均支持刺五加可能通過對DRD2的甲基化和表達的調節(jié)從而改善CV癥狀。以上研究表明，DRD2的表觀遺傳學檢測是CV診斷和治療的潛在標志物。

刺五加是我國東北地區(qū)常見的傳統(tǒng)草藥，常用于治療神經(jīng)退行性疾病，如腦缺血和抑郁[19]。已證實刺五加通過調節(jié)小膠質細胞的活化發(fā)揮對神經(jīng)的保護作用[7]。促炎(M1)表型和抗炎(M2)表型是小膠質細胞活化的2種不同表型[20]，根據(jù)研究，刺五加通過調節(jié)巨噬細胞的CD163、CD11b、CD80、CD64，從而促進巨噬細胞向M2型極化發(fā)展[21]。本研究數(shù)據(jù)也顯示刺五加下調小膠質細胞的M1表型CD16、CD32、CD86，但上調M2表型Arginase 1、CD206的mRNA和蛋白水平。這表明刺五加可能通過促進小膠質細胞的抗炎表型的激活從而對CV疾病發(fā)揮調節(jié)作用，可能是刺五加改善CV的另一個關鍵機制。

本研究仍存在樣本量的限制，因此需要更大的患者樣本；此外，需進一步設計實驗確定刺五加對DRD2基因表達調節(jié)的下游機制及對小膠質細胞M1/M2極化調節(jié)的機制。

綜上所述，本研究初步證實CV患者經(jīng)刺五加治療后DRD2啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化率，且刺五加可促進小膠質細胞向M2型極化發(fā)展，我們的研究為CV疾病的診斷靶點探索及對刺五加治療CV的機制研究提供實驗基礎。