李全志，鄭林靜，劉志強

0 引言

胃癌是常見癌癥，也是全球第三大癌癥相關(guān)死亡原因[1-2]。近年來，盡管關(guān)于胃癌診斷、手術(shù)技術(shù)和新型分子靶向藥物等方面的研究取得了很大的進步，但是胃癌患者的5年總生存率仍然較低，進展期胃癌患者5年死亡率高達30%～50%[3]。黃芪甲苷IV是一種羊毛脂醇型四環(huán)三萜皂苷，是中藥黃芪的主要活性成分，具有多種藥理作用，如抗炎、抗纖維化、抗氧化、抗哮喘、抗糖尿病和免疫調(diào)節(jié)作用[4]。此外，黃芪甲苷IV已被證明在某些癌癥中具有抗腫瘤特性，可抑制腫瘤細胞的存活、遷移和侵襲[5]。紫杉醇是從短葉紅豆杉樹皮中分離出來的一種具有紫杉烯環(huán)結(jié)構(gòu)的二萜類化合物，對人類多種疾病有效，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥和慢性腎臟疾病[6]。紫杉醇是治療癌癥的有效藥物之一，但是單一紫杉醇的抗癌能力有限，與其他抗癌藥物相比，紫杉醇的有效劑量較高，化療效果并不理想[7]。因此，研究者們不斷探索新的紫杉醇聯(lián)合用藥方案，以期提高胃癌的治療效果[8]。本研究旨在探究黃芪甲苷IV和紫杉醇聯(lián)合用藥對胃癌細胞的作用及其可能的機制，以期為開發(fā)胃癌新的治療策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人胃癌細胞株AGS購自武漢普諾賽生命科技有限公司；黃芪甲苷IV購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；紫杉醇購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自美國AbMole公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax和Bcl-2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；STAT3、NF-κB、pSTAT3和pNF-κB抗體購自英國Abcam；GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology；超敏ECL發(fā)光液購自北京英格恩生物科技有限公司；Transwell小室購自美國康寧；Matrigel購自德國Sigma-Aldrich。

1.2 細胞培養(yǎng) 將液氮中凍存的AGS細胞取出，37 ℃水浴快速解凍，離心棄上清，1 ml含10%FBS 的Ham′s F-12培養(yǎng)基重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔板中，補加Ham′s F-12培養(yǎng)基至2 ml。細胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次新鮮培養(yǎng)基。待細胞密度達到6孔板面積的80%～90%時，0.25%胰酶液消化細胞，按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.3 黃芪甲苷IV和紫杉醇IC50的檢測 0.25%胰酶液消化AGS細胞，新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，制成單細胞懸液。取AGS細胞接種到96孔板中，每孔100 μl細胞懸液(5×103個細胞)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基。將細胞隨機分為0 μg/ml組、5 μg/ml組、10 μg/ml組、20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組和160 μg/ml組，按照分組，分別添加用不同濃度的黃芪甲苷IV和紫杉醇配制得到的培養(yǎng)基100 μl，0 μg/ml組添加等量溶劑。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。CCK-8試劑盒檢測各組細胞活力，細胞活力(%)=(不同濃度組OD值/0 μg/ml組OD值)×100%，GraphPad Prism5.0軟件計算黃芪甲苷IV IC50和紫杉醇IC50。

1.4 CCK-8試劑盒細胞活力檢測 對數(shù)期生長的AGS細胞經(jīng)消化后，新鮮Ham′s F-12培養(yǎng)基重懸細胞，制成單細胞懸液。取AGS細胞接種到96孔板中，每孔100 μl細胞懸液(5×103個細胞)。將細胞隨機分為對照組、黃芪甲苷IV組、紫杉醇組和聯(lián)合組，其中黃芪甲苷IV組添加黃芪甲苷IV IC50濃度，紫杉醇添加紫杉醇IC50濃度，聯(lián)合組添加黃芪甲苷IV IC50濃度+紫杉醇IC50濃度，對照組添加等量溶劑。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，向每孔內(nèi)加入10 μl CCK-8溶液，細胞于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度(OD)。細胞活力(%)=(處理組OD值/對照組24 h OD值)×100%。

1.5 集落形成實驗檢測細胞增殖 對數(shù)期生長的AGS細胞經(jīng)消化后，新鮮Ham′s F-12培養(yǎng)基重懸細胞，制成單細胞懸液。取300個對數(shù)期生長的AGS細胞接種于培養(yǎng)板中，將細胞隨機分為對照組、黃芪甲苷IV組、紫杉醇組和聯(lián)合組，按照 “1.4”項下 進行給藥處理。細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2周，直至出現(xiàn)肉眼可見克隆。棄去細胞培養(yǎng)基，PBS清洗后，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色1 h，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 0.25%胰酶液消化AGS細胞，新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，制成單細胞懸液。接種2 ml AGS細胞懸液于6孔板中，每孔細胞數(shù) 5×105個，將細胞隨機分為對照組、黃芪甲苷IV組、紫杉醇組和聯(lián)合組，按照 “1.4”項下進行給藥處理。細胞置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集AGS細胞，預冷PBS清洗細胞。加入200 μl的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，5 μl的Annexin V-FITC混勻，加入10 μl的PI混勻，室溫避光反應20 min，立即上流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測Bax、Bcl-2和STAT3-NF-κB途徑相關(guān)蛋白的表達 0.25%胰酶液消化AGS細胞，新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，制成單細胞懸液。接種2 ml AGS細胞懸液于6孔板中，每孔4×105個細胞。繼續(xù)培養(yǎng)細胞12 h后，棄去舊培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。按照“1.4”項下進行分組給藥處理，24 h后收集細胞。裂解液裂解細胞，收集上清液，測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。每組各取30 μg蛋白加入SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)電泳分離，隨后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉液室溫封閉2 h，Bax抗體稀釋液(1∶500)、Bcl-2抗體稀釋液(1∶500)、STAT3抗體稀釋液(1∶2 000)、NF-κB抗體稀釋液(1∶2 000)、pSTAT3抗體稀釋液(1∶2 000)、pNF-κB抗體稀釋液(1∶2 000)和GAPDH抗體稀釋液(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。超敏ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 消化對數(shù)期生長的AGS細胞，無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至5×105個/ml。取100 μl細胞懸液加入Transwell小室中，另取600 μl含20% FBS的Ham′s F-12培養(yǎng)基加入下室中，按照“1.4”項下對細胞進行分組給藥處理，細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出小室，棄去培養(yǎng)基，甲醛固定30 min，風干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察、記數(shù)。以上為遷移實驗步驟。

進行侵襲實驗前，將Transwell小室用Matrigel包被，待Matrigel凝固后，接種AGS細胞于有Matrigel包被的小室中，其余步驟與遷移實驗步驟相同。細胞在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出小室，棄去培養(yǎng)基，甲醛固定30 min，風干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察、記數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷IV及紫杉醇對胃癌細胞使用濃度篩選 與0 μg/ml組相比，黃芪甲苷IV 5 μg/ml組和10 μg/ml組細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，黃芪甲苷IV 20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組和160 μg/ml組細胞活力明顯降低(P<0.05)。黃芪甲苷IV IC50=63.99 μg/ml，此為后續(xù)實驗中黃芪甲苷IV的使用濃度。見圖1。

圖1 黃芪甲苷IV及紫杉醇對胃癌細胞使用濃度的篩選

與0 μg/ml組相比，紫杉醇 5 μg/ml組細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，紫杉醇10 μg/ml組、20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組和160 μg/ml組細胞活力明顯降低(P<0.05)。紫杉醇IC50=40.08 μg/ml，此為后續(xù)實驗中紫杉醇的使用濃度。見圖1。

2.2 黃芪甲苷Ⅳ聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞增殖 與對照組相比，黃芪甲苷Ⅳ組、紫杉醇組和聯(lián)合組的細胞活力明顯降低(P<0.05)；與聯(lián)合組比較，黃芪甲苷Ⅳ組和紫杉醇組的細胞活力明顯升高(P<0.05)。此外，與對照組相比，黃芪甲苷Ⅳ組、紫杉醇組和聯(lián)合組的細胞克隆形成數(shù)明顯降低(P<0.05)；與聯(lián)合組比較，黃芪甲苷Ⅳ組和紫杉醇組的克隆形成數(shù)明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 黃芪甲苷IV聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞增殖

2.3 黃芪甲苷Ⅳ聯(lián)合紫杉醇誘導胃癌細胞凋亡 與對照組相比，黃芪甲苷Ⅳ組、紫杉醇組和聯(lián)合組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，細胞Bax蛋白表達明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與聯(lián)合組相比，黃芪甲苷Ⅳ組和紫杉醇組的細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，細胞Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 黃芪甲苷IV聯(lián)合紫杉醇誘導胃癌細胞凋亡

2.4 黃芪甲苷Ⅳ聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞遷移和侵襲 與對照組相比，黃芪甲苷Ⅳ組、紫杉醇組和聯(lián)合組的細胞遷移和侵襲數(shù)明顯降低(P<0.05)；與聯(lián)合組比較，黃芪甲苷Ⅳ組和紫杉醇組的細胞遷移和侵襲數(shù)明顯升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 黃芪甲苷IV聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞遷移和侵襲(200×)

2.5 黃芪甲苷Ⅳ聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞STAT3-NF-κB途徑活化 與對照組相比，黃芪甲苷Ⅳ組、紫杉醇組和聯(lián)合組細胞中pSTAT3/ STAT3和pNF-κB/NF-κB蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與聯(lián)合組相比，黃芪甲苷Ⅳ組和紫杉醇組細胞中pSTAT3/STAT3和pNF-κB/NF-κB蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 黃芪甲苷IV聯(lián)合紫杉醇抑制胃癌細胞STAT3-NF-κB途徑活化

3 討論

根治性胃切除術(shù)仍是目前治療胃癌的主要方法。然而，即使經(jīng)過根治性手術(shù)和充分的淋巴結(jié)切除術(shù)，進展期胃癌患者的生存率仍然很低[9]。因此，探索和優(yōu)化治療策略對提高胃癌患者的生存效益至關(guān)重要。本研究應用黃芪甲苷Ⅳ和紫杉醇處理胃癌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷Ⅳ、紫杉醇和兩者聯(lián)合用藥均可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。此外，兩者聯(lián)合用藥比單一用藥對胃癌細胞的作用更為明顯。

研究表明，黃芪甲苷Ⅳ可誘導肝癌細胞的細胞毒作用和外源性/內(nèi)源性凋亡效應，還可引起肝癌細胞周期阻滯，降低肝癌細胞抗凋亡蛋白的表達，并抑制肝癌細胞的侵襲能力[10]。黃芪甲苷Ⅳ除了參與調(diào)節(jié)癌細胞生物學行為外，在調(diào)節(jié)癌癥耐藥方面也發(fā)揮重要作用。黃芪甲苷Ⅳ通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬增加非小細胞肺癌細胞對順鉑的化療敏感性，抑制細胞活力，促進細胞凋亡[11]。紫杉醇由于其廣譜的抗腫瘤活性成為治療多種晚期和難治性癌癥最有效的抗腫瘤藥物之一。但紫杉醇產(chǎn)生的顯著副作用限制了其作為抗癌藥物的最佳臨床效用。因此，紫杉醇聯(lián)合用藥成為了研究者們的關(guān)注重點之一。

在腫瘤微環(huán)境中，STAT3-NF-κB通路在基質(zhì)細胞和腫瘤干細胞中被結(jié)構(gòu)性激活。STAT3-NF-κB通路的激活可促進腫瘤的生長，促進腫瘤干細胞標志物的表達和侵襲力，增強腫瘤細胞對順鉑的耐藥性[12]。除了在腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和免疫抑制中的作用外，STAT3-NF-κB途徑還通過調(diào)節(jié)microRNAs表達、腫瘤干細胞維持和腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境促進癌癥的進展[13]。研究表明，二甲雙胍通過抑制STAT3-NF-κB的激活抑制IL-6誘導的乳腺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞增殖和遷移[14]。異甘草苷元是從甘草中提取的一種天然黃酮類化合物，通過ROS介導的STAT3-NF-κB信號通路的抑制，誘導肝癌細胞凋亡[15]。從以上的研究成果不難看出，STAT3-NF-κB信號通路可能是治療腫瘤的潛在靶點之一。本實驗結(jié)果顯示，pSTAT3/STAT3和pNF-κB/NF-κB蛋白表達明顯降低，說明黃芪甲苷IV、紫杉醇處理胃癌細胞，可導致STAT3和NF-κB磷酸化水平下降，STAT3-NF-κB信號通路受到抑制。此外，兩者聯(lián)合用藥比單一用藥對胃癌細胞STAT3-NF-κB信號通路的抑制作用更為明顯。

綜上所述，黃芪甲苷Ⅳ聯(lián)合紫杉醇可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。該作用可能是通過抑制STAT3-NF-κB信號通路實現(xiàn)的。